基因克隆测序与原核表达

 根据GenBank中登录的犬瘟热病毒h基因序列设计一对引物，利用RT-PCR方法扩增出犬瘟热病毒弱毒疫苗株的h基因，将其插入到克隆载体pMD18-T中，经蓝白斑筛选及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定挑出阳性克隆进行序列测定，序列分析结果表明，该基因与GenBank上标准代表毒株序列完全同源；与扬州分离株、长春分离株、新疆分离株、日本分离株D85755同源性分别为90.6%、91.3%、90.5%、91%；与Onderstepoort、Convac株、美国分离株98-2666-2同源性较高，分别为97.7%、97.2%、98.1%。再将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中，转化感受态E.coli BL21细胞，经IPTG诱导表达分子质量约64 ku的重组H蛋白。     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒F基因序列设计了1对引物，以从水貂犬瘟热病毒中提取的RNA为模板，扩增出一约1000bp的F基因片段。将PCR产物按相应的阅读框架克隆到原核表达载体pET-32a中，并将重组质粒转化E．coli BL21（DE3），用1．0mmol／L IPTG在30℃下诱导表达。结果显示，F基因的表达量约占细菌总蛋白的35％。SDS-PAGE电泳显示，表达产物的分子质量约为55ku，与预计大小相符；经Western-blotting试验进一步证实，该基因获得了正确表达。     

犬瘟热病毒水貂分离株F1基因的克隆表达

本研究旨在利用基因工程的方法,制备犬瘟热(canine distemper,CD)疾病诊断用抗原。提取犬瘟热病毒基因组,RT-PCR扩增犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)F1基因序列,克隆并测序。将F1基因定向克隆到原核表达载体pET28a多克隆位点,阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达产物,并用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。结果显示表达的F1重组蛋白能与犬瘟热标准阳性血清发生反应,具有良好的反应原性,可以作为犬瘟热疾病的诊断用抗原。     

犬瘟热病毒贵州株融合蛋白基因原核表达质粒的构建

为了研究犬瘟热病毒贵州株(CDV-GZ1)完整融合蛋白(F),试验采用PCR方法以pMD18-F质粒为模板,利用特异性引物扩增获得大小为1 989 bp的目的 DNA,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32a(+)-F。结果表明:目的基因插入位置和阅读框均正确,说明F基因原核表达质粒构建成功;质粒pET32a(+)-F在BL21(DE3)中经诱导表达未获目的蛋白,说明CDV融合蛋白可能不适合在该表达系统中进行完整蛋白的表达。     

水貂犬瘟热病毒受体SLAM的原核表达

为了获得犬瘟热病毒受体信号淋巴激活分子(SLAM)蛋白,本试验以pMD18-T-SLAM为模板,应用PCR方法扩增得到水貂SLAM基因,将SLAM基因连接到经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切处理后的pGEX-6p-1原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-6p-1-SLAM,转化至大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,并通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果表明,目的基因插入位置和阅读框正确,经诱导成功表达出分子质量约为63.2ku的SLAM-GST融合蛋白,该融合蛋白能与鼠抗GST标签单克隆抗体发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

新城疫病毒HN基因功能结构域的原核表达

本研究对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)分离株sc05的HN基因进行了克隆、序列测定,在此基础上将其C端功能结构域76－571 aa片段亚克隆到pET32a(＋)表达载体上,构建重组表达质粒pET32a-HN,鉴定正确后转化进BL21 plysS(DE3)细胞,筛选出阳性克隆,用1 mmol/L IPTG 诱导表达,并对表达产物进行鉴定。SDS-PAGE电泳结果显示,HN基因功能结构域片段在 BL21 plysS(DE3)细胞中实现融合表达,表达产物大小约为76 ku,Western blotting试验证实其能与NDV阳性血清反应。本研究为进一步研究HN蛋白功能结构域的免疫原性和研制鸡新城疫HN基因工程疫苗奠定了基础。     

犬瘟热病毒H蛋白的原核表达及免疫原性的初步鉴定

本研究旨在对犬瘟热病毒(CDV)疫苗株H基因进行克隆及原核表达,并对产物的免疫原性做初步鉴定。根据犬瘟热病毒参考株Ondetstepoort的H基因序列,去除信号肽序列并选取其主要抗原表位设计引物,用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的片段;产物克隆至表达载体pET28b并转化宿主菌Rosetta^TM,优化诱导表达条件,纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE鉴定、Western blotting分析及间接酶联免疫吸附试验(ELISA);并将纯化的H蛋白免疫小鼠,进行中和试验检测抗体效价。结果显示,PCR扩增得到1113 bp DNA片段;在37 ℃、1.0 mmol/L IPTG诱导条件下可获得较高水平的表达;经SDS-PAGE鉴定,表达的H蛋白分子质量为42.38 ku,与预期值相符;Western blotting显示,在42.38 ku出现特异性目的条带;ELISA结果显示,表达的H蛋白能被抗CDV抗体识别,但与正常血清未发生非特异性反应;中和试验结果表明,血清中和抗体效价约为2^－3.3。结果提示,H蛋白获得了正确表达,对CDV抗血清具有特异反应性,可作为实时检测动物机体免疫状况检测的候选抗原,为进一步研制犬瘟热抗体检测ELISA试剂盒和新型疫苗奠定基础。     

犬瘟热病毒Yunnan株H基因的克隆与表达

根据已发表的犬瘟热病毒(CDV)Onderstepoort株的序列设计两对引物,以犬瘟热病毒云南株感染的Vero细胞收获病毒提取的总RNA为模板,RT-PCR扩增出H基因的939 bp(H基因前段,H1)和920 bp(H基因后段,H2)片段,分别将其定向克隆于PET-28a( )中,将重组质粒转化宿主菌BL21(DE3)plysS,在35℃1、.0 mmol/L IPTG诱导下获得良好表达,经SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白为34 ku,与预期大小一致。免疫印迹试验显示,该重组蛋白可被CDV Onderstepoort株多克隆抗体识别,表明该重组蛋白具有抗原性。     

犬瘟热病毒疫苗株H蛋白基因片段的克隆与表达及表达产物抗原性的初步鉴定

根据发表的犬瘟热病毒（CDV）参考株Ondetstepoort的序列设计一对引物,以CDV感染的Vero细胞总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到549bpDNA片段,将该片段以正确的阅读框架定向克隆于pGEX-4T-1中,然后将重组质粒转化宿主菌Rosetta^TM,在37℃、1．0mmol／LIPTG诱导下外源基因获得良好表达。经SDS．PAGE鉴定,表达的融合蛋白约46ku,与预期值一致。Westernblot试验显示,CDV免疫的小鼠血清可特异的识别该重组蛋白,表明该重组蛋白具有一定的免疫原性。     

犬瘟热病毒H基因的序列分析与表达

以临床疑似犬瘟热病犬外周血总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增犬瘟热病毒(CDV)血凝素(H)基因。序列测定和分析表明该病料犬瘟热病毒H基因序列与国内其他地区分离到的毒株同源性较高(94.6%~99.2%),而与Onderstepoort株、Convac株等疫苗毒株的同源性较低(90.4%~91.2%)。分子遗传进化分析显示所有毒株可分为7个大的分支,且各分支间具有一定的地域性,其中待检病料中CDV与大多数中国分离株一样处于Ⅰ型。进一步以H全基因为模板,截短表达其3′端816 bp、459 bp两个片段,并克隆入原核表达载体pET30 a进行表达。结果显示它们分别能表达大小约为36.4 ku和22.2 ku的融合蛋白。免疫转印表明该纯化蛋白均可与犬瘟热病毒抗血清发生阳性反应,说明重组蛋白具备抗原性,可用于进一步的血清学研究。     

犬瘟热病毒上海株N蛋白编码基因的克隆与序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)核蛋白（N）基因序列，设计合成1对特异性引物，以CDV上海（SH）株的总RNA为模板，RT-PCR扩增N蛋白基因，并进行克隆与序列分析。结果显示：CDV SH株N蛋白基因序列与CDV TN株、 A75/17 株、2544/Han95株、98-2654 株、5804株、Onderstepoort疫苗株的同源性分别为98.9%、97.6%、96.7%、96.9%、96.6%、93.9%；编码氨基酸的同源性分别为99.0%、98.7%、98.1%、97.9%、97.9%、96.9%。推测N蛋白是一个保守性非常强的结构蛋白。     

水貂源犬瘟热病毒F基因真核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体PMD-18T-CDVF,用KpnI和BamHI双酶切克隆质粒PMD-18T-CDVF后,回收F基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pcDNA3.1真核表达载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-CDVF。经DNA测序、限制性内切酶分析和PCR鉴定,证实成功地构建了重组质粒,从而为研究犬瘟热新型疫苗奠定了基础。     

犬瘟热病毒野毒株融合蛋白主要功能区基因的变异研究

根据犬瘟热病毒（ＣＤＶ）融合蛋白（Ｆ）基因的核苷酸序列，设计合成了１０条引物。用１对引物从延吉犬病料中扩增出了含Ｆ２区基因的３１４ｂｐ的片段。除两端引物序列外为２６５ｂｐ，编码８８个氨基酸。它与日本弱毒株（ＣＤＶ－Ｄ，Ｏｏｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株（ＣＤＶ－ＯＮ）、海豹瘟热病毒２型（ＰＤＶ２）、１型（ＰＤＶ１）在核苷酸和氨基酸水平上的同源性，分别为９８．１％和９５．５％、９６．２％和９３．２％和     

犬瘟热病毒贵州株(CDV-GZ1)F基因的克隆及序列分析

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒Onderstepoort株融合蛋白基因(F)序列设计两对特异性引物,采用RT-PCR扩增犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)的F基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV-GZ1株F基因的ORF全长1989 bp,氨基酸序列中具有5个潜在N-糖基化位点,氨基酸同源性与美国00-2601株和国内HL株较高,分别为91.6%和91.1%,表明该分离株与00-2601株和HL株具有较近的亲缘关系。     

犬瘟热病毒贵州分离株H基因的克隆及其序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒Onderstepoort株序列设计特异性引物,以犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)RNA为模板,应用RT-PCR对病毒H蛋白编码基因进行了扩增、克隆及序列分析.测序结果表明,CDV-GZ1 H基因ORF由1 824 bp组成,可编码607个氨基酸;与已发表23株其它CDV H基因核苷...     

貉源犬瘟热病毒血凝素基因的克隆及序列分析

为了对1例貉源犬瘟热(CD)进行病毒检测并分析其血凝素H基因变异情况,本研究从1只疑似犬瘟热病死的貉采病料进行研磨,利用RT-PCR方法扩增犬瘟热病毒H基因,对扩增出的H基因片段进行克隆测序,并对得到的H基因序列进行分析。结果表明,该貉感染犬瘟热病毒,得到的H基因核苷酸和氨基酸序列与CDV野毒株同源性较高,分别为89.1%~98.0%和85.4%~97.5%。遗传进化分析表明其属于Asia-1型野毒株,N连接糖基化位点分析结果表明,该毒株在542aa处比参考野毒株多了1个潜在的N糖基化位点,在525aa-550aa间多出了1个抗原表位。     

犬瘟热病毒N基因和M基因的克隆与序列分析

以从宠物临床上分离的犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)总RNA为模板,根据GenBank中已报道的CDV核蛋白（N）、基质膜蛋白（M）基因序列,分别设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增N、M蛋白编码基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,均扩增出预期大小的片段。扩增片段经核苷酸序列分析,N、M编码基因全长分别为1572、1008 bp,该CDV的N蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为93.9%、97.6%,编码氨基酸的同源性分别为96.9%、98.7%;M蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为94.5%、97.8%,编码氨基酸的同源性分别为97.9%、99.7%,这说明N、M蛋白均是保守性较强的结构蛋白,且同强毒株A75/17的亲缘关系要比Onderstepoort疫苗株更近。     

犬瘟热病毒N基因和M基因的克隆与序列分析

以从宠物临床上分离的犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）总RNA为模板,根据GenBank中已报道的CDV核蛋白（N）、基质膜蛋白（M）基因序列,分别设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增N、M蛋白编码基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,均扩增出预期大小的片段。扩增片段经核苷酸序列分析,N、M编码基因全长分别为1572、1008 bp,该CDV的N蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为93.9%、97.6%,编码氨基酸的同源性分别为96.9%、98.7%;M蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为94.5%、97.8%,编码氨基酸的同源性分别为97.9%、99.7%,这说明N、M蛋白均是保守性较强的结构蛋白,且同强毒株A75/17的亲缘关系要比Onder-stepoort疫苗株更近。     

犬瘟热病毒山东株的分离及N蛋白基因的克隆与序列分析

本试验采用Vero细胞从临床疑似患犬瘟热的犬组织病料中分离出一株病毒,通过观察细胞病变,提取细胞培养物RNA并扩增克隆分析N蛋白基因部分序列进行了鉴定。结果表明,该毒株接种于Vero细胞后,出现了典型的细胞病变;对接种病料后的Vero细胞培养物提取总RNA进行RT-PCR扩增,得到了287 bp的目的片段;序列分析表明该分离株与犬瘟热病毒弱毒(Onderstepoort和Snyder Hill)的同源性为95.5%~96.9%,与标准强毒株(A75/17和2544/Han95)及野毒株(XJ-4、ZJ7、98-2646等)的同源性较高,为97.2%~99.0%,证明该毒株为犬瘟热病毒野毒株,命名为QD10。     

貂源犬瘟热病毒f基因酵母表达载体的构建和鉴定

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒f基因序列设计一对引物,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的f基因,将其插入到克隆载体pMD18-T中,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后纯化回收,与经同样的酶酶切消化后并纯化回收的载体pPICZaA连接并转化E.coliDH5α,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子,阳性克隆菌经PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定表明目的基因插入位置、方向和阅读框正确。证明pPICZaA-f酵母表达载体构建成功。