牛出血性败血症胶体金免疫层析快速诊断方法的建立

根据胶体金免疫层析技术原理,用胶体金标记纯化的兔抗巴氏杆菌IgG-A,应用提纯的兔抗巴氏杆菌IgG-B包被硝酸纤维素膜检测线用羊抗兔IgG包被对照线,制备了检测多杀性巴氏杆菌抗原的快速检测试纸条。结果表明,研制的试纸条不与牛的其他病原的抗原反应,具有较高的特异性;该试纸条的最高检出稀释度为1∶640;该胶体金免疫层析技术与菌体检查的符合率为100%。该方法具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛出血性败血症进行普查和检疫。     

柱状黄杆菌胶体金免疫层析快速检测方法的建立

为建立一种通过胶体金免疫层析技术快速检测柱状黄杆菌的方法,试验采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20 nm的胶体金颗粒,将其标记纯化的抗柱状黄杆菌单克隆抗体(McAb)制备出金标抗体结合垫。纯化的兔抗柱状黄杆菌多克隆抗体(PcAb)和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线(T)与质控线(C)上,制备出胶体金免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度、特异性及稳定性进行测定。结果显示,该试纸条检测灵敏度为1×10³ CFU,检测时间为3.5 min,制备的试纸条与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌均无交叉反应,且稳定性好。本研究首次成功建立了柱状黄杆菌胶体金快速检测方法,所制备的试纸条具有灵敏、特异、稳定、快速等优点,可用于柱状黄杆菌的检测。     

口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究

利用单克隆抗体技术制备抗口蹄疫病毒的单克隆抗体,特异性试验表明其只与O、A、Asia 1型3种血清型FMDV抗原结合。进而采用胶体金标记技术,以胶体金标记的抗口蹄疫病毒单克隆抗体、多克隆血清抗体和葡萄球菌A蛋白为主要材料,研制口蹄疫快速检测试纸条。该试纸条检测O、A、Asia 1型3种血清型灭活口蹄疫病毒均为阳性,检测水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒、猪蓝耳病病毒4种灭活抗原及小反刍兽疫病毒疫苗株均为阴性,试验结果与口蹄疫实时荧光定量RT-PCR方法的完全一致,表明其具有良好的特异性。敏感性试验结果是,试纸条的检测极限为1∶160稀释的样品,其敏感性相当于实时荧光定量RT-PCR方法的1/64。由于试纸条具有操作方便、检测快速等优点,因此该试纸条可以用于大量临床样品的快速检测和现场检测。     

快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金免疫层析方法的建立

为建立一种快速、简便、灵敏的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金颗粒,标记抗PRRSVN蛋白的单克隆抗体(MAb) 2D7制备免疫检测探针,将抗PRRSVN蛋白的MAb 1G7和羊抗鼠IgG抗体印迹在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化,组装成胶体金免疫层析试纸条.本研究制备的PRRSV胶体金试纸条的最低检测限度为103.0 TCID50/mL;在特异性试验中,试纸条检测PRRSV呈阳性,其它主要猪病病原均为阴性;不同批次试纸条重复检测,结果无差异;对现地猪场送检的150份病料进行PRRSV病原检测,与RT-PCR相比较,试纸条的特异性和敏感性分别为98.13％和88.37％.两种方法的一致性Kappa值为0.882.建立的PRRSV抗原胶体金免疫层析检测方法具有良好的的敏感性、特异性、重复性及现地应用性.该试纸条的研制为PRRS的快速诊断及免疫预防提供了技术手段.     

牛结核胶体金免疫层析快速诊断方法的建立及初步应用

建立一种快速检测牛结核抗体的方法,用以诊断牛结核病。根据胶体金免疫层析技术原理,用兔抗牛血清蛋白和大肠埃希菌表达的牛分支杆菌MPB70-83-ESAT-6蛋白分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获杭原,制备牛结核抗体检测试纸条。结果表明,MPB70-83-ESAT-6抗原的最适包被浓度为2.5mg/mL;研制的试纸条不与牛的其他疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性;该试纸条的最高检出稀释度为1∶640;试纸条与TST的符合率为80%。该试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用

为了建立一种快速检测牛分支杆菌抗体的新方法用于诊断牛结核病,利用胶体金免疫层析技术原理,用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条.结果表明,粒径为40 nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.0,MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5 μg,MPB70抗原的最适包被浓度为3.0 mg/mL,抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5 mg/mL,交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性.比较试验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条.在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较.本试纸条与牛分支杆菌分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%.快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景.     

鉴别布鲁菌病自然感染动物与疫苗免疫动物胶体金检测试纸条的研制

用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）标记胶体金技术制作金标垫,以亲和层析法纯化的BP26蛋白作为检测抗原（T线）,研制胶体金快速检测试纸条。用建立的试纸条检测小鼠布鲁菌感染血清,可成功鉴别牛布鲁菌S19感染和BP26缺失疫苗株YZ-2免疫的小鼠。试纸条检测与布鲁菌属同源性较近的几株细菌的阳性血清,结果无交叉反应;试纸条敏感性高于虎红平板凝集试验检测方法,近似于ELISA方法;准确性同于ELISA法,且更为简便快捷。该试纸条具有鉴别布鲁菌病自然感染和疫苗免疫的应用前景。     

鸡毒支原体胶体金免疫层析试纸条的研制和初步应用

为研制一种用于快速检测鸡毒支原体(MG)的胶体金免疫层析试纸条,采用直径20nm的胶体金颗粒标记纯化的MG多克隆抗体,硝酸纤维素膜检测线和质检线分别喷加纯化的MG多克隆抗体和兔抗鸡IgG抗体,制作胶体金试纸条。试纸条检测MG阳性显示两条红色反应条带;阴性为一条红色反应带。本试纸条可检测到1∶1 280倍稀释的MG抗原,即颜色变化单位为8×104 CCU/mL,具有高度的灵敏性。用试纸条检测衣原体、滑液支原体、猪肺炎支原体、鸡大肠埃希菌和鸡白痢沙门菌等均呈阴性,表明该试纸条具有较好的特异性。对试纸条检测呈MG阳性的38只病鸡进行MG培养验证,所得结果一致;同时对MG培养检测的另外95份病鸡样品进行试纸条测试比对,符合率为96.84%,证明该试纸条具有很高的准确性。该胶体金免疫层析试纸条检测MG操作简单,灵敏度、准确度、特异性等均符合要求,可以用于养殖场批量MG的检测。     

大片形吸虫免疫胶体金检测试纸条的研制及初步应用

为建立一种快速、简便、适应现场应用的水牛大片形吸虫检测方法,本试验利用抗大片形吸虫ES抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株7D1和7D4分别制备和纯化得到单克隆抗体7D1和7D4;采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒大小为30 nm的胶体金,再用胶体金标记纯化单克隆抗体7D1,在硝酸纤维素膜的质控带和检测带处分别包被羊抗鼠IgG二抗和单克隆抗体7D4,经反应条件优化,组装成了大片形吸虫免疫检测试纸条。经测试该检测试纸条对ES抗原的检测下限为0.94 μg/mL,与胰扩盘吸虫、前后盘吸虫、支原体、弓形虫、伊氏锥虫均无交叉反应,特异性好。采集广西地区334份水牛新鲜粪样并用试纸条检测,阳性率为38.62%。结果表明,试纸条方法操作简单、快速、易于判定,特异性好,敏感性高,适合基层大面积普查和现场检测大片形吸虫。     

鸭坦布苏病毒E蛋白Domain Ⅲ单克隆抗体胶体金试纸条的创制及应用

为建立一种快速诊断鸭坦布苏病毒（DTMUV）的方法,以2株（B9D7B8G10和B9D10C7株）抗DTMUV的单克隆抗体制备DTMUV胶体金免疫层析试纸条。采用经典的柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液,利用rProtein G琼脂糖凝胶亲和层析法对两株单克隆抗体腹水进行纯化并鉴定;以纯化的B9D7B8G10株单克隆抗体作为标记抗体,通过调节单克隆抗体浓度与pH确定胶体金探针最佳结合条件;同时,在硝酸纤维素膜（NC膜）检测带包被纯化的B9D10C7株单克隆抗体,质控带包被山羊抗小鼠IgG抗体,建立检测DTMUV胶体金免疫层析试纸条;成功建立试纸条后,对试纸条敏感性、特异性、重复性和稳定性进行检测,并与RT-PCR检测方法进行比较,对200份临床疑似感染样品进行检测。结果显示：制备的胶体金试纸条在15 min内即可完成检测,最低检测稀释度为1:50,且不与鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅星状病毒、禽白血病病毒发生交叉反应;应用试纸条和RT-PCR方法分别对200份临床疑似样品进行检测,两者符合率达98%。结果表明,制备的胶体金试纸条敏感性高、特异性强、稳定性好、重复性好,为DTMUV的快速检测提供了...