用农杆菌介导法将大豆球蛋白基因导入水稻

在克隆水稻谷蛋白基因Gt1启动子的基础上,以农杆菌双元载体pCAMBIA1301为起点,构建出以该启动子带动大豆球蛋白A1aB1b亚基基因表达的双元载体,并用农杆菌介导法转化水稻获得转基因植株.经PCR检测和后代分析,大豆球蛋白基因已整合入水稻基因组,并在后代中稳定遗传.     

籼稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证

从籼稻（Oryzasativa L.ssp.indica）品种谷秆两用稻‘东南201’中克隆获得胚乳特异性启动子Gt1;序列全长为929 bp;含胚乳中特异表达所必需的正调控元件GCN4 motif（TGAGTCA）与Skn-1 motif（GT-CAT）等。与已报道的粳稻品种‘日本晴’的序列相比,籼稻‘东南201’Gt1启动子序列仅在-507 bp处发生一个碱基突变,在-268、-267、-194、-193 bp位置处分别缺失1个碱基;但在已知功能motif,两者没有任何差异。用Gt1替代35SCa MV启动子驱动GUS基因转化水稻‘台粳9号’,结果表明GUS基因仅在胚乳中特异表达,而在其它组织中未表达。克隆的籼稻谷蛋白基因Gt1的启动子序列,可为进一步开展水稻品质分子改良提供必要手段。     

β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体的构建

【目的】构建β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因具有功能性间隔序列的发夹结构（Intron-hairpin RNAi,ihp-RNA）的RNA干扰(ihp-RNAi)表达载体并转化大豆,为通过RNA干扰技术改良大豆的营养品质奠定基础。【方法】以大豆总RNA反转录获得的cDNA为模板,通过PCR扩增克隆了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的核心保守序列(400 bp),并将该片段的反义和正义片段插入到重组植物表达载体p3301P的种子特异性启动子7αp下游,将功能性间隔序列intron-SSR插入反义片段与正义片段之间,构建α′-亚基基因ihp-RNAi安全型表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,并进行PCR及双酶切鉴定。利用农杆菌介导法将带有p3301-PFNZ-α′-BADH 的菌株转化“吉农27”大豆植株,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,并对转基因植株α′-亚基基因的表达量进行RT-PCR。【结果】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,利用农杆菌介导法转化大豆得到7株阳性转化植株;Southern杂交结果显示,外源基因以1～2个拷贝整合于大豆基因组中;RT-PCR检测表明,β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的表达被明显抑制。【结论】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体,获得了α′-亚基基因被明显抑制的转基因大豆植株,为应用基因工程技术进行大豆品质改良奠定了基础。     

H5亚型AIV的HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因的杆状病毒共表达载体的构建

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感(AIV)血凝素(HA)基因序列及鸡白细胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)的cDNA基因序列,分别设计了HA1和mChIL-18的cDNA的2对引物。然后以pMD18-T-HA质粒和pGEX-mChIL-18质粒为模板,扩增出了H5亚型AIV的HA1基因和mChIL-18的cDNA片段。再以杆状病毒pFastBacTM dual为载体,将H5亚型AIV HA中的HA1基因和mChIL-18基因分别插入到双表达载体pFastBacTM dual的p10启动子(PP10)和多角体蛋白启动子(PPH)的下游,构建携带HA1基因和mChIL-18基因的重组pFastBacTM dualH-A1-mChIL-18真核表达质粒。最后将构建的真核表达质粒转座入大肠杆菌DH10Bac,为下一步进行昆虫细胞的转染奠定了基础。这个重组载体的构建为考察mChIL-18作为免疫增强剂的作用及下一步AIV疫苗的研究奠定了坚实的基础。     

Bt基因介导的大豆抗蚜虫表达载体的构建

[目的]构建用于大豆抗蚜虫研究的Bt基因介导的Cry1Ac植物表达载体。[方法]以含有Cry1Ac的质粒pRH201为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至载体质粒pBS中,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。经验证的Cry1A基因扩增产物双酶切后与pBI121载体连接转化,挑取重组子pBIC121进行BamHⅠ／SnaBⅠ双酶切鉴定。[结果]从pRH201质粒中扩增获得长约3．5kb的Cry1Ac基因序列,对重组质粒pBSCRY的插入片段进行测定,确定了CrylAc片段的全长为3534bp,共编码1176个氨基酸。[结论]构建了Cry1A基因的植物表达载体,为大豆抗蚜虫转基因研究奠定了基础。     

阿拉拉特小麦高分子量谷蛋白新基因1Gy的克隆及序列分析

利用y-型高分子量谷蛋白亚基的特异引物,对阿拉拉特小麦(PI427305)的基因组DNA进行PCR扩增,得到大小为2.2 kb的目的条带,将该条带回收纯化并克隆到pMD18-T载体中,经梯度亚克隆测序拼接,得到编码区的全序列为2 202 bp(GenBank登录号:HM131806),共编码732个氨基酸。它与1Gy7*序列的同源性高达99%,而且氨基酸序列结构与大多数y-型亚基相同,推断该基因为1Gy。1Gy的分子量比1Gy7*稍小,迁移率比1Gy7*慢。与小麦属其他基因组编码的y-型亚基相比,其在靠近C端的重复区多了一个半胱氨酸残基。利用在线PSIPRED对其二级结构预测结果显示,其重复区主要是无规则卷曲结构。这些结构都可能使得1Gy对小麦加工品质产生正面影响。     

大豆7S与11S球蛋白QTL元分析及候选基因挖掘

大豆蛋白作为重要营养来源,其含量在大豆种子中约占40%。7S球蛋白（b-伴大豆球蛋白）和11S球蛋白（大豆球蛋白）约占种子总蛋白70%,其含量直接影响大豆蛋白品质及特性。因此,大豆7S与11S球蛋白含量相关QTL定位与候选基因挖掘非常重要。研究调查国内外已报道的42个7S与11S球蛋白相关QTL数据,通过利用BioMercator ver.2.1软件对其进行元分析得到11个Meta-QTL区间。利用《京都基因与基因组百科全书》和基因本体数据库分析Meta-QTL区域基因,确定18个参与调控7S与11S球蛋白含量的相关基因作为候选基因,该候选基因分别参与植物生长发育、氨基酸生物合成等过程。其中1个基因被注释为编码2S白蛋白超家族蛋白,6个基因与蛋白质合成相关细胞器的生长发育相关,5个基因被注释为编码影响贮藏蛋白积累的转录因子家族蛋白,6个基因与贮藏蛋白运输的分子机制相关。研究结果对大豆7S和11S球蛋白相关QTL定位及分子辅助育种具有重要意义。     

人pot1基因cDNA的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的：克隆人端粒保护蛋白（human proteetlon of telomeres 1.pot1）基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法：RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法（电泳迁移率改变分析）检测hpot1基因的表达水平。结果：来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论：真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

靶基因Bi-1RNAi重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建靶向人Bax Inhibitor-1（Bi-1）基因的shRNA慢病毒重组载体。方法借助siRNA设计工具,并结合文献资料选取Bi-1基因编码序列中有效的干扰靶点,根据连接载体中的酶切位点自行设计并人工合成干扰靶点的一对反义脱氧寡核苷酸链,先定向克隆到pU6载体（pU6-Bi-1-shRNA）,再经双酶切后克隆到慢病毒包装质粒LunIG,得到靶向Bi-1基因沉默的慢病毒包装重组质粒LunIG-Bi-1。重组质粒经PCR法进行初筛后,再通过双酶切电泳和目的基因沉默效果的检测保证插入序列的正确性。结果靶向沉默Bi-1基因的shRNA序列成功插入到慢病毒包装质粒LunIG中。结论靶向Bi-1基因沉默的慢病毒shRNA包装重组质粒构建成功。     

玉米受伤诱导基因Wip1的启动子克隆及表达分析

【目的】植物蛋白酶抑制剂是抵抗动物摄食和病原侵染的重要防御蛋白。玉米Wip1(wound-induced protein)基因属于Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)家族,了解Wip1(wound-induced protein)的启动子活性和Wip1组织表达特性、受胁迫诱导表达情况和在不同受伤时间下的表达模式,为抗虫基因在植物中应用提供新信息。【方法】以玉米叶片组织的cDNA为模板,采用克隆测序技术获得Wip1启动子序列和该基因的cDNA序列。将所得启动子与植物表达载体p1300连接,构建重组表达载体p1300-Wip1-GUS,并采用冻融法将其转入农杆菌LBA4404中。利用农杆菌介导的瞬时表达体系在玉米愈伤组织中对Wip1启动子的表达活性进行分析。利用热酚法提取玉米相应组织的总RNA,纯化后于含甲醛的变性胶中电泳分离,并将RNA转移到尼龙膜上,用[α-32P]dCTP标记探针的Northern blot技术对Wip1在玉米不同组织、不同胁迫条件、不同受伤时间下的表达模式进行分析。【结果】获得的启动子序列全长1 737 bp,cDNA全长512 bp。将含有重组质粒p1300-Wip1-GUS的农杆菌侵染玉米愈伤组织,3 d后,GUS染色显示侵染部位变蓝,说明所克隆的启动子在玉米愈伤中能启动GUS正常表达。基于Northern blot技术的植物组织表达结果显示,正常情况下,Wip1仅在胚芽鞘中有一定的表达,在受伤后的胚芽鞘、根、茎、叶、雌穗、雄穗、花丝及苞叶中均大量表达;在所设置的胁迫处理时间(2 h)内,Wip1不受缺氧、低温、脱水、PEG、ABA、NaCL和IAA胁迫诱导,仅受伤害胁迫诱导表达;Wip1在玉米叶片受伤胁迫下,玉米叶片受伤2 h时,检测到了Wip1表达,4—24 h时表达量迅速提高且处于持续增加趋势。【结论】玉米Wip1特异地受机械伤害诱导表达;Wip1启动子是一种有效的伤害诱导特异性启动子。     

拟南芥DCL1启动子的分离及其表达特性分析

Dicer酶是类似于RNase Ⅲ的核酸内切酶,能够特异性地将双链RNA剪切成约20 nt的小RNA,在基因沉默途径中起到非常重要的作用。从拟南芥中分离出DCL1基因上游启动子序列2 kb及DCL1基因的5′端1 kb序列,构建了含有该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,并对转基因植株进行GUS 组织化学染色及荧光定量分析,结果表明,在DCL1基因启动子的驱动下,报告基因GUS主要在拟南芥的叶片中表达,在幼嫩的叶片及茎尖中表达量也比较高,茎中的表达量较低,在根中只有微量的表达。     

禽类血管活性肠肽与乙肝病毒核心抗原融合基因的构建

在制备以禽类血管活性肠肽（VIP）为基础的基因工程疫苗工作中，选择乙肝病毒核心抗原（HBcAg)作为载体来提高鹅VIP的免疫原性，首先将克隆于鹅VIP cDNA和HBc基因第1至435bp的序列片段先后插入到质粒pRSET A的BamH I/EcoR I和Nhe I/BamH I克隆位点之间，构建成VIP序列位于HBc序列之后的VIP融合基因的重组质粒pHBc-VIP,其次将HBc第1至225bp序列的扩增片段和HBc第244bp之间包括VIP的充列经扩增，EcoR I酶切，连接，再扩增的片段先后插入到质粒pBSKS /－的BamH\Pst和Pst\HindⅢ克隆位点，构建成VIP持入到HBc基因中间（HB cAg的第75和82位氨基酸之间）融合基因的重组质粒pVIP-HBc.     

水稻OsRFP1基因的原核表达与蛋白纯化

以推导的氨基酸序列分析,水稻OsRFP1基因编码一分子量为34.24kDa锌指蛋白。将OsRFP1基因编码区cDNA序列插入到pGEX4T-3载体中构建OsRFP1-gst融合基因的表达载体,并将质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21DE3。经IPTG诱导,融合蛋白在BL21DE3细胞中获得表达。利用亲和层析的方法对融合蛋白进行了纯化,SDS-PAGE蛋白电泳显示获得一60kDa的唯一蛋白条带,即OsRFP1-GST融合蛋白。     

拟南芥PhrIP1基因超表达、GFP和RNAi载体的构建

根据编码拟南芥成膜素相关蛋白(PhrIP1)基因cDNA全序列设计超表达引物,以1～1000bp之间序列设计GFP引物和序列内部第24～240bp之间序列设计RNAi引物,以pMD18-T-PhrIP1为模板,用PCR方法分别扩增出1.8kb、1.0kb和0.216kb的片段,分别克隆至双元表达载体、GFP载体和RNAi载体上,得到了植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1。用电转化法,将这些重组质粒导入农杆菌GV3101菌株中,PCR扩增结果表明所构建的植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP融合载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1已导入农杆菌。     

水稻线粒体nad1基因超表达载体的构建和遗传转化(英文)

[目的]克隆线粒体相关基因nad1,获得转nad1的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cDNA为模板,扩增得到nad1;将nad1接到线粒体信号肽Rf1b的5 (Rf1b5 ),装载到pCAMBIA1305.1双元表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]克隆的目的基因nad1大小为978 bp,成功构建了携带线粒体信号肽的nad1植物表达载体,并获得了转nad1基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中过表达nad1对水稻生长的影响奠定了基础。