牛血凝块基因组DNA提取方法的建立

建立了一种牛血凝块基因组DNA提取方法，其过程为机械性粉碎，高盐EDTA处理后用含蛋白酶K和SDS的细胞裂解液消化，苯酚-氯仿抽提，再以本方法抽提的DNA为模板进行PCR扩增，对PCR产物测序，测序结果与抗凝血DNA的PCR产物测序结果比较。结果表明：本方法提取的DNA成功地应用于PCR扩增。     

猪耳组织DNA的快速提取

采用一步法提取的猪基因组DNA,可直接用于PCR扩增、单链构象多态性(SSCP)分析及测序。操作步骤为:采取新鲜猪耳组织2～10mg,蛋白酶K消化,55℃1h,滤纸过滤消化产物。取孔径为1.2mm的滤纸(含有足量的DNA)作为模板进行PCR扩增。结果表明,提取的基因组DNA质量较高,PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和SSCP分析后可见清晰的条带,可进一步用于克隆测序。滤纸上的DNA干燥后可常温保存。该方法简单、快速,成本低,效率高,适用于大批量的基因分型,也可用于提取不同组织的基因组DNA。     

绵羊嗜皮菌病PCR诊断方法的建立

为建立动物嗜皮菌病的PCR检测方法,根据GenBank发表的刚果嗜皮菌属的部分16s-rRNA基因序列,设计了1对特异性引物.经PCR扩增,从发病绵羊皮肤病料提取的基因组DNA得到了大小约500 bp的DNA片段.将PCR产物克隆并测序表明,与GenBank发表的刚果嗜皮菌基因序列的同源性为90.632%.而猪胸膜肺麦放线杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、肠球菌扩增结果为阴性;PCR的敏感性试验显示,这时引物能够检测到1 ng的DNA.表明此PCR方法特异性好,敏感性高,可用于嗜皮菌病的快速诊断.     

番鸭源鸭疫里默氏菌大环内脂类药物的耐药基因检测与分析

为了解莆田市番鸭源鸭疫里默氏菌对大环内酯类药物的耐药性和相关耐药基因携带情况,对本实验室分离鉴定的49株番鸭源鸭疫里默氏菌菌株采用K-B纸片扩散法进行药敏试验,提取菌株基因组DNA,采用PCR方法对大环内酯类药物的ermA、ermB、ermC、ermF、ereD等5种耐药基因进行检测,阳性产物送公司测序并对序列进行分析...     

新兴猪干扰素-β基因的分子克隆与序列测定

根据NCBI GenBank 上登载的猪干扰素β基因序列(S41178),设计一对引物,直接从猪肝脏提取基因组DNA,经PCR 扩增及扩增产物的克隆、测序,获得了新兴本地猪干扰素β全基因片段,其大小为561 bp,与NCBI GenBank上登载的猪干扰素β基因序列完全一致,为进一步研究和开发猪基因工程干扰素制剂奠定了基础。     

牛基因组DNA两种提取方法的比较研究

研究哺乳动物基因组DNA的水煮抽提法，并将传统的酚仿抽提法和水煮法进行比较，水煮法即通过对细胞的煮沸和冷却，使细胞破裂、蛋白变性，从而获得用于PCR扩增的模板DNA的方法。通过电泳分析和PCR扩增检测了所提取基因组DNA的完整性、可行性。检测时采用3对引物对2种方法提取的DNA进行了PCR扩增，同时对冷冻保存的基因组DNA也进行了扩增检测。结果表明：水煮法提取基因组DNA是一种快速、简便、经济、高效的方法。     

基于线粒体12S rRNA基因序列鉴别牛肉的种源

在提取黄牛肉、牦牛肉和水牛肉总DNA的基础上,设计通用引物进行PCR扩增,电泳回收PCR产物后双向测序,再通过构建系统进化树鉴别牛肉的物种来源.PCR扩增获得的牦牛、水牛12S rDNA基因片段大小都为440 bp,黄牛12S rDNA基因片段大小都为439bp.参照引用的不同牛种12S rDNA基因序列,构建的系统进化树能够清晰地鉴别测序样品的牛种来源.因此,结合运用PCR扩增和DNA测序技术是一种精确可靠的方法,能够有效地运用于牛肉的种源鉴别.     

应用PCR技术检测柞蚕微孢子虫

采用斑迹抽提法提取柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)基因组DNA,基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱中有大小约15kb的清晰、完整条带。选用已报道的微粒子属16S rRNA基因的保守序列设计P1/P2和N1/N22对引物,对柞蚕微孢子虫基因组DNA进行PCR扩增,结果2对引物分别扩增出1条大小不同的特异谱条带,其中用引物N1/N2扩增可检测出0.47ng的DNA模板。应用同样的PCR引物、体系和反应条件,可有效扩增出受感染柞蚕幼虫、成虫中的微孢子虫基因组DNA条带。该项检测技术有望应用于柞蚕微粒子病的早期诊断。     

基于线粒体12S rRNA基因序列鉴别牛肉的种源

 在提取黄牛肉、牦牛肉和水牛肉总DNA的基础上,设计通用引物进行PCR扩增,电泳回收PCR产物后双向测序,再通过构建系统进化树鉴别牛肉的物种来源。PCR扩增获得的牦牛、水牛12S rDNA基因片段大小都为440 bp,黄牛12S rDNA基因片段大小都为439 bp。参照引用的不同牛种12S rDNA基因序列,构建的系统进化树能够清晰地鉴别测序样品的牛种来源。因此,结合运用PCR扩增和DNA测序技术是一种精确可靠的方法,能够有效地运用于牛肉的种源鉴别。     

用改进的酚-氯仿法提取鱼类基因组DNA效果的分析

提取鱼类基因组DNA的研究报道并不多见,效果也各有差异。本文以泰山螭霖鱼、东平湖鲤鱼、东平湖鲫鱼为材料,采用改进的酚-氯仿法提取基因组DNA,并进行了紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳、微卫星PCR扩增等方法的鉴定。结果表明,本方法提取的基因组DNA浓度在0.9μg/μL~3.25μg/μL之间,A260/A280比值在1.79~1.87之间,电泳条带整齐明亮,适合微卫星PCR扩增,且整个操作过程使用试剂较少,简单易行。     

一种禽类血液基因组DNA高效提取通用方法的建立

为了建立一种适合禽类血液的廉价、高效、通用的基因组DNA提取方法,试验采用鸡、鸭、鹅、鸽、火鸡、麻雀6种禽类血液为材料,提取的禽类血液DNA经微量分光光度计分析、基因组DNA凝胶成像分析以及PCR扩增效果检测。结果表明:提取的6种禽类血液DNA质量较好(OD260/OD280值范围为1.80~1.84,OD260/OD230值范围为2.21~2.30),基因组DNA电泳主条带和PCR扩增产物条带清晰、整齐、无拖带。说明本方法能够完全适用于大批量禽类血液基因组DNA的提取,且DNA纯度较好,满足后续相关分子生物学试验要求。     

区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的PCR-RFLP方法的建立

根据GenBank登录的鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）非结构蛋白（NS）基因特征,本研究设计1对特异性引物对GPV和MDPV基因组DNA进行PCR扩增,目的片段大小均为810 bp,并对PCR产物进行切胶回收。用EcoRⅠ酶对GPV和MDPV特异性胶回收产物进行酶切鉴定,结果显示MDPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段,大小为530和280 bp;而GPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。本研究建立了一种快速区别GPV和MDPV感染的检测方法,可对番鸭感染水禽细小病毒的情况进行快速鉴别诊断。     

猪附红细胞体PCR诊断方法的建立及应用

根据基因库中已登录的猪附红细胞体新的基因组DNA序列设计引物,从疑似猪附红细胞体(Mycoplasma suis)感染猪全血样品基因组DNA中扩增出了预期长度666 bp的目的DNA片段,通过对24份临床疑似病例样品的PCR扩增及其他病原微生物基因组DNA的特异性扩增试验,建立了E.suis的PCR诊断方法;进一步对PCR产物克隆、测序分析表明,与国外已报道的AJ504999株相关区域核苷酸、氨基酸序列同源性分别为98.19%和96.85%,表明我国分离株与国外株基因组存在差异。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因片段的克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计合成一对引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序.结果显示扩增产物为300bp,与预期的目的片段大小一致,经PCR、酶切反应鉴定后克隆到pGEM-Teasy载体中,核苷酸序列经BLAST软件分析表明:番鸭呼肠孤病毒MW9170株S1基因的目的片段与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为91.7%,与鸡关节炎病毒S2基因同源性为68.7%,结果提示番鸭呼肠孤病毒MW9710株与鸡关节炎病毒亲缘距离较远.     

蒙古马肠道细菌总DNA提取方法的比较

本试验采集蒙古马新鲜粪便样品,采用酚－氯仿抽提法和2种细菌基因组DNA提取试剂盒法进行样品中细菌基因组DNA的提取。通过DNA浓度和纯度的测定,并将其作为模板扩增细菌16S rDNA V3区特异性片段对提取效果进行比较,从而找出更适合蒙古马粪便中细菌基因组DNA的提取方法。结果显示,3种提取方法得到的基因组DNA均能用于PCR扩增的模板,其中B试剂盒法提取的DNA数量较多,且纯度高,更适合用于提取蒙古马肠道微生物细菌基因组DNA及后续的蒙古马肠道微生物多样性等分子生物学试验。     

用改进的酚-氯仿法提取鱼类基因组DNA效果的分析

提取鱼类基因组DNA的研究报道并不多见,效果也各有差异。本文以泰山螭霖鱼、东平湖鲤鱼、东平湖鲫鱼为材料,采用改进的酚-氯仿法提取基因组DNA,并进行了紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳、微卫星PCR扩增等方法的鉴定。结果表明,本方法提取的基因组DNA浓度在0．9μg／μL～3．25μg／μL之间,A260／A280比值在1．79～1．87之间,电泳条带整齐明亮,适合微卫星PCR扩增,且整个操作过程使用试剂较少,简单易行。     

冷冻原肠中细菌基因组DNA提取方法的建立

为建立冷冻原肠中细菌基因组DNA的直接提取法,采用震荡洗脱、金属网过滤和梯度离心相结合的方法,对2份冷冻原肠样品进行前处理;对经前处理后的原肠样品,采用酚/氯仿法提取细菌基因组DNA,然后进行琼脂糖电泳和OD_(260)/OD_(280)比值测定;以细菌基因组DNA为模板,用PCR技术扩增细菌16S rDNA并构建克隆文库,并从2个文库中各随机挑取3个菌落进行16S rDNA的PCR鉴定和DNA测序。结果显示:样品提取的DNA浓度、纯度较高,OD_(260)/OD_(280)比值介于1.8～2.0;挑取的6个菌落中,1个为阴性,剩余5个为阳性,为肠球菌属(Enterococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)的5种细菌。结果表明,本研究提取的原肠细菌基因组DNA质量较好,可用于非培养法研究冷冻原肠中细菌的多样性。本研究解决了因缺乏原肠细菌基因组DNA提取方法,无法进一步应用现代分子生物学方法研究冷冻原肠细菌的多样性、菌群组成结构和动态变化等难题。     

中国麇鹿朊蛋白核心片段的原核克隆表达与纯化

从采取的新鲜麋鹿血液中提取麋鹿基因组DNA,通过PCR的方法从麋鹿基因组中扩增麋鹿PrP蛋白核心片段的DNA,并分别在引物的5′和3′端引入EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点,下游引物将原序列TATTAC突变为TAAT从变成两个终止密码子。通过两个酶切位点将麋鹿PrP蛋白核心片段DNA连接到pET-32a（＋）,转化DH5α,通过酶切鉴定和PCR鉴定,筛选出阳性克隆送菌液测序,从测序结果分析阳性克隆是否符合要求。测序正确后将核心片段基因连接到pET-32a（＋）,阳性质粒命名为MPrP-pET-32a（＋）,阳性质粒转化E.coli BL21（DE3）,进行诱导表达、蛋白质纯化鉴定。     

犬附红细胞体PCR检测方法的建立

目的 步建立犬附红细胞体PCR检测方法。方法 据已发表的附红细胞体基因序列,设计了一对特异性引物,以犬附红细胞体基因组DNA和附红细胞体可疑病犬样品DNA为模板,聚合酶链式反应（PCR）扩增,扩增产物经克隆测序分析。结果 CR扩增产物大小为541bp,序列分析表明与GenBank数据中发表的序列一致,表明这套引物成功扩增出目的基因序列,但正常犬血样品DNA和弓形虫、伊氏锥虫、吉氏巴贝斯虫、犬细小病毒、犬瘟热的DNA样品都不能扩增出目的基因片段。结论 研究建立的PCR方法可以用于犬附红细胞体的检测,为犬附红细胞体病的诊断及分子流行病学的调查提供了新的手段。