绵羊胚胎细胞核移植的研究

采用国产药品和试剂对绵羊进行超数排卵和胚胎细胞核移植。以 McGrath Solter 和Willadsen 两种去(注)核方法,将8-细胞胚胎细胞核经电融合植入去核成熟卵母细胞内,并经琼脂包埋和中间受体培养,使移核胚胎发育。实验结果表明:(1)用国产激素和化学药品进行绵羊胚胎细胞核移植可使移核胚胎在中间受体内发育为囊胚或桑椹胚;(2)去核时卵母细胞质剩得过少可导致移核胚过早(6-细胞期)发生致密化或形成内细胞团细胞数目较少的小囊胚;(3)Willadsen 去(注)核方法的去核和注核操作成功率明显优于 McGrath-Solter 方法;应用McGrath Solter 法的去核率仅为60%;(4)强度为0.63KV/cm,持续160微秒(μs)的一次电脉冲获得的胚胎融合率最高,达71.2%;以同样电场条件刺激未去核卵母细胞的孤雌活化率在71.4%。     

绵羊胚胎冷冻保存及移植的研究

本研究的目的在于建立绵羊胚胎的慢速冷冻和玻璃化快速冷冻保存方法,为绵羊胚胎移植技术应用于生产提供保证。结果:慢速冷冻保存,解冻后正常胚胎占72％,移植受体的受胚率33％、产羔率66％。玻璃化快速冷冻保存,解冻后正常胚胎率亦达72％,移植受体3只,产羔4只。     

不同氧气浓度对绵羊体外受精胚胎凋亡相关基因表达的影响

[目的]研究绵羊胚胎体外发育过程中细胞凋亡的机制,以进一步提高胚胎体外发育能力。[方法]利用Real-time PCR技术,分别检测凋亡相关基因Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3在低氧环境(5%O2)和高氧环境(20%O2)培养的绵羊体外受精(IVF)胚胎中的表达水平。[结果]不论是高氧环境还是低氧环境,从2-细胞阶段到囊胚期均可检测到Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3的表达,Caspase-3基因表达水平随着胚胎的发育有逐渐增高的趋势,且高氧和低氧间差异不显著(P0.05);从8-16细胞期开始,Mcl-1、Bad、Bak和Bik表达水平都显著增加,且低氧环境中的表达水平均明显低于高氧环境中的表达水平(P0.05)。[结论]氧气浓度在一定程度上影响了绵羊胚胎中凋亡相关基因的表达,绵羊胚胎细胞凋亡可能是凋亡相关基因Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3相互协同的结果。     

绵羊体外受精的TCM199渐变培养体系的研究

应用TCM199作卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎培养的基础培养液,再添加不同组分组成TCM199体外受精渐变培养体系,进行绵羊体外受精的研究.结果表明:TCM199体外受精渐变培养体系(试验组)与目前沿用的常规体外受精体系(对照组)相比较,虽然成熟率差异不显著(81.3%,80.4%),但能显著提高绵羊卵母细胞体外受精后的卵裂率(72.1%,50.8%)和桑囊率(94.8%,24.5%).这说明TCM199体外受精渐变培养体系能有效地克服早期胚胎发育阻断.     

绵羊ICSI胚胎培养液中发情绵羊血清浓度优化研究

在胚胎培养液中添加适量的发情绵羊血清(ESS)有利于提高胞浆内单精子注射(ICSI)胚胎后期的发育潜力.为了探讨在ICSI胚胎培养液中添加不同浓度的ESS对绵羊ICSI胚胎桑椹胚率的影响及其最优的ESS浓度,本试验采用ICSI技术得到ICSI胚胎,然后在ICSI胚胎培养液中添加不同浓度的ESS(A组0％、B组5％、C组...     

KSOM无血清培养液在绵羊胚胎体外培养应用的研究

本文利用KSOM、TCM-199+20％人血清和KSOM+20％人血清培养绵羊体外受精胚胎,以研究KSOM作为绵羊胚胎体外培养无血清培养液的可能性。实验结果说明,KSOM支持绵羊胚胎早期发育至囊胚期,而在KSOM中添加血清后,胚胎可发育至孵化囊胚,而且孵化囊胚率高于常用的TCM-199+血清(24％vs 7％)(p<0.05)。说明KSOM可以用于绵羊胚胎早期发育的无血清培养液。     

整合素αvβ3介导EPCs修复损伤血管内皮及补阳还五汤的干预作用

目的 探讨补阳还五汤促进EPCs修复损伤血管内皮的作用,从归巢环节阐释其作用机制,为中医药防治心脑血管疾病提供参考。方法 以补阳还五汤灌胃及尾静脉输注EPCs作用于内皮损伤的模型大鼠,从血管内皮形态、EPCs归巢等方面评价内皮损伤修复情况,从整合素αvβ3和αvβ5介导的SDF-1/CXCR-4信号通路了解该方促进EPCs归巢的机制。结果 与单用EPC组（E组）和单用药物组（b组）比较,补阳还五汤联合EPC组（B组）αvβ3表达显著增加（P<0.05）,血管SDF-1表达显著增高（P<0.01）。结论 补阳还五汤能促进EPC修复损伤的血管内皮,其作用机制可能与该方能上调整合素αvβ3介导的SDF-1信号通路相关蛋白,促进EPCs的归巢有关。     

绵羊8—16细胞胚胎的超微结构

利用透射电镜技术研究了绵羊８－１６细胞胚胎的超微结构，并与２细胞胚胎作了比较．结果表明，８－１６细胞胚胎卵裂球间以间隙连接联系，胞质主要成分是一种带有界膜的囊泡，线粒体丰富，以带帽线粒体为主，也有少量横嵴线粒体，１６细胞胚胎中，后者的比例高于８细胞胚胎．与２细胞胚胎相比，８─１６细胞胚胎的高尔基体发达．但滑面内质网数量减少、８细胞胚胎卵裂球具有数个致密的球形或环形核仁前体，１６细胞胚胎的核仁中出现次级小泡腔，标志着ｒＲＮＡ开始合成．     

蒙古绵羊早期胚胎心脏的组织发生

蒙古绵羊早期胚胎的血岛是心管及血管组织发生的原基。交配后１２～１３日龄,在胚盘两侧的胚内中胚层内,首先发生血岛,进而扩展到原肠及尿囊的脏层。在１６～１８日龄,前肠腹面的心管,由单管状变形成Ｕ字袢,进而扭转成字形。因心管中段的收缩,出现心房、心室及动脉球三个膨大。２０～３０日龄,胚长４～１５ｍｍ,在房室管内,发生前后对称的心内膜垫,将房室管分隔成左及右房室口。由于心房内,第Ⅰ第Ⅱ房间隔发生,将心房分隔成左及右心房。再由于心室内室间隔的发生,将心室分隔成左及右心室。心管传导系统的窦房结,在１６～１８日龄,发生于静脉窦右侧心外膜下,此时心管的窦房部开始搏动。本文发现,在２１～２２日龄,胚长６～８ｍｍ时,静脉窦右侧心外膜下的窦房结细胞团散在。在房间隔壁内与心内膜垫相接处,房室结的细胞团群居。还发现,绵羊胚胎的心软骨原基,发生于３０日龄,胚长１５ｍｍ时,心软骨原基位于主动脉半月瓣外围水平上与肺动脉之间。     

蒙古绵羊早期胚胎动脉系统的组织发生

蒙古绵羊胚胎发育到１７ｄ１７ｈ 第Ⅰ对鳃弓动脉发生，到２１ 日龄第Ⅱ～Ⅵ对鳃弓动脉相继发生，其中第Ⅰ、Ⅱ及Ⅴ对鳃弓动脉又退化，仅第Ⅲ、Ⅳ及Ⅵ对鳃弓动脉发育成永久性动脉。从２１ ～２４ 日龄，动脉干内的干嵴发生并吻合，因此动脉干被分隔成主动脉及肺动脉。在此同时，动脉球内的球嵴也吻合分隔成两个通道与上述动脉相通。胚胎的肺芽开始发生于２０ 日龄，到２２ 日龄肺动脉已向肺芽发出分支，到２４ 日龄肺静脉已从肺芽伸入左心房。从１８ ～２０ 日龄，第Ⅲ对鳃弓动脉背段分化成颈内动脉，腹段分化成颈外动脉。从２０ ～２１ 日龄，锁骨下动脉从两侧对称的背主动脉发生，随着右侧背主动脉退化，右臂头动脉前移与左锁骨下动脉合并成臂头动脉总干。从１３ ～２４ 日龄，肠系膜前动脉、腹腔动脉和肠系膜后动脉相继发生。胚胎发育到２０ ～２４ 日龄，背主动脉后端中央发生中荐动脉，两侧分出脐动脉分布于尿囊，在脐动脉根部发出髂外动脉分布于后肢芽。     

蒙古绵羊早期胚胎静脉系统的组织发生

蒙古绵羊胚胎发育到１７ｄ、１７ｈ,心房两侧有３对静脉原基发生,包括总主静脉,脐静脉及脐肠系膜静脉。胚胎发育到３０ｄ龄,左总主静脉右移分化成冠状静脉。右总主静脉则分化成前腔静脉。３０ｄ龄以后,左及右前主静脉间发生吻合,称左臂头静脉。左及右臂头静脉合并后汇总于前腔静脉。胚胎发育到２９ｄ龄,后主静脉前段及中段退化,后段分化成总髂静脉。脐肠系膜静脉发生于卵黄静脉。胚胎发育到２０～３０ｄ龄,在中肾的腹内侧发     

蒙古绵羊胚胎大肠黏膜上皮的组织发生

[目的]研究蒙古绵羊胚胎大肠黏膜上皮的组织发生。[方法]利用组织学常规方法。[结果]蒙古绵羊胚胎大肠黏膜上皮的发育经历了单层细胞到复层细胞再到单层细胞的过程;杯状细胞在37 mm胚初见;90 mm胚直肠腺开始发育,142 mm胚盲肠、结肠肠腺开始发育。[结论]蒙古绵羊胚胎大肠黏膜上皮经历了单层细胞到复层细胞再到单层细胞的发育过程。     

基于绵羊胚胎骨骼肌蛋白质组学的PI3K-AKT信号通路分析

【目的】绵羊是重要的经济动物,其骨骼肌生长发育与产肉性能密切相关。胚胎期是绵羊骨骼肌生长发育的关键阶段,挖掘分析绵羊胚胎骨骼肌蛋白质组数据,为揭示绵羊肌肉发育重要时间节点、筛选绵羊胚胎骨骼肌生长发育调控蛋白质提供依据。【方法】本团队已对妊娠第85天、第105天和第135天的中国美利奴绵羊胚胎背最长肌进行串联质谱(tandem mass tag, TMT)蛋白质定量,鉴定到1316种差异丰度蛋白质。现利用GO、KEGG和R等方法对这些差异丰度蛋白质开展聚类、功能注释和通路分析等生物信息学分析。【结果】基于前期研究结果对差异丰度蛋白质进行R语言聚类,分析结果显示,cluster 5类蛋白在胚胎骨骼肌第105天具有较高丰度。对cluster 5 蛋白进行GO和KEGG富集分析发现,该类蛋白质参与胞内蛋白质代谢过程,显著富集于PI3K-AKT信号通路中,而在该信号通路中RAC-β丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶X1(AKT2)具有较高表达丰度。蛋白质生物信息学结果表明,AKT2蛋白由481个氨基酸构成,AKT2蛋白理论分子量为55.58kD,由66个带正电荷的氨基酸残基和72个带负电荷的氨基酸残基组成,理论等电点为6.08,亲水性平均系数-0.454,属于亲水性蛋白。预测AKT2蛋白的481个氨基酸全部位于膜外,属于膜受体蛋白。AKT2蛋白有12个N-端糖基化位点,71个磷酸化位点,与蛋白酶K相似度为99%,属于蛋白酶催化亚基家族。【结论】绵羊胚胎骨骼肌蛋白质组数据发现,第105天是绵羊胚胎骨骼肌纤维由增殖分化到增大增粗的转折点,具有调控绵羊胚胎骨骼肌纤维生长发育作用的PI3K-AKT信号通路在该节点显著富集,AKT2是调控该信号通路的重要候选蛋白。综上,本研究结果对揭示胚胎骨骼肌生长发育及其调控分子机制具有重要理论指导意义。     

绵羊胚胎不同发育阶段及其组织中MicroRNA-483-5p表达分析

[目的]研究MicroRNA(miR)483-5p在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织中的表达变化,以了解其在绵羊胚胎发育中的重要作用.[方法]选择中国美利奴羊胚胎不同发育时期(45、85、115和135 d 4个时期)肾脏和脐带组织为研究材料,采用半定量RT-PCR检测第45d绵羊胚胎不同组织中miR483-5p的表达;同时利用实时荧光定量PCR对miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织的表达变化进行实时检测.[结果]miR-483-5p在所检测的绵羊45 d胚胎各组织中广泛表达,其中以肌肉、心脏和肺脏组织表达丰度最高.实时荧光定量PCR结果显示,不同发育阶段绵羊胚胎肾脏和脐带组织miR -483-5p的表达具有明显的时空选择性.脐带组织miR-483-5p随着胚胎发育其表达量呈逐渐下降的趋势;肾脏组织miR-483-5p则是随着胚胎发育在第85 d其表达量下降到最低,其后在115和135 d其表达量又逐渐上升.不同发育阶段胚胎肾脏、脐带组织miR-483-5p的表达量呈显著性差异(P＜0.05).[结论]miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏或脐带组织中表达明显不同,表明其表达具有选择性;依据miR -483-5p表达的差异性及其涉及的生物学功能,推测miR-483-5p在绵羊脐带和肾脏组织中具有一定的调控作用.研究为进一步了解miR-483-5p在胚胎肾脏和脐带发育中的作用机制提供一定的理论依据.     

蒙古绵羊早期胚胎泌尿及生殖器官的发生

E12～16d(意指胚胎发育到12～16d),在胚中轴形成期显示出原肾遗迹。E17～30d,中肾发育成长梭状,悬于背系膜两侧。E21～～30d,后肾芽由杆状变成椭圆形,在肾盂与集合管的周围被后肾组织包围。中肾管与后肾管先后通向尿囊基部。 E24d,胚长10mm,生殖腺发育成长梭状,突向体腔。胚长14mm,米勒氏管的原基呈皱襞状,发生于中肾前部两侧,并向后移位于中肾管外侧。 E21d,尿殖窦腹面开始分化出尿道沟,伸向生殖结节的顶部。E6～30d,生殖结节由丘状变成圆锥形。     

蒙古绵羊胚胎胃肌间神经丛的发生

[目的]研究绵羊胚胎胃肌间神经丛的发生。[方法]运用组织学方法,对蒙古绵羊5~550 mm胚胎胃肌间神经丛的发生进行研究。[结果]32 mm胚胎,可观察到胃肌间神经丛组成细胞与周围的间充质细胞相似;164 mm胚的胃肌间神经丛神经元细胞体与32 mm胚比较,增大了近1倍,分化更明显;发育到550 mm胚时,神经元显现出特有的形态。[结论]胚胎发育至550 mm时,神经元的形态已近成熟。     

绵羊LDHβ基因的生物信息学分析及其在不同剩余采食量绵羊肝脏和肌肉组织中的表达

【目的】为鉴定绵羊乳酸脱氢酶β(lactate dehydrogenase B,LDHβ)基因的分子特征,研究其在不同剩余采食量绵羊肝脏和肌肉组织中的表达差异.【方法】测定了137只‘湖羊’公羔的剩余采食量(residual feed intake,RFI),按RFI进行排序,分别筛选出RFI最高(high-residual feed intake,H-RFI)和RFI最低(low-residual feed intake,L-RFI)的羊各15只,屠宰后,采集肝脏和肌肉组织,利用Q-PCR技术检测绵羊LDHβ基因分别在H-RFI和L-RFI羊肝脏和肌肉中表达量,并利用生物信息学软件构建了该基因的系统进化树和预测其结构与功能.【结果】绵羊LDHβ基因开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 005bp,编码334个氨基酸,其蛋白质分子质量为36 479.43U,理论等电点为6.40.绵羊LDHβ基因与山羊的亲缘关系较近,其次为牛,序列同源性高.功能结构域预测结果显示,该基因编码产物在内质网中参与辅酶因子生物合成的可能性最高.Q-PCR结果显示,绵羊LDHβ-mRNA基因在L-RFI羊肝脏和肌肉中表达量均显著低于H-RFI羊(P0.01).【结论】绵羊LDHβ基因作为能量代谢的关键酶参与绵羊饲料效率的调控.     

3β,5α,6β,15β-四羟基-16-孕甾烯酮衍生物的合成与波谱分析

利用氧化还原反应,对生物转化的3β,5α,6β,15β-四羟基-16-孕甾烯酮进行了化学修饰,得到了四个新的化合物,以波谱方法进行结构表征。同时对3β,5α,15β-三羟基-16-孕甾烯-6,20-二酮的单晶进行了结构分析。     

蒙古绵羊早期胚胎的消化及呼吸器官的发生

蒙古绵羊胚胎的原肠、消化及呼吸器官,内分泌腺的原基,发生在交配后的8～30d。胚胎发育到20～21d,胚长4～6mm;到22～23d,胚长7～9mm;到24～30d,胚长10～15mm。交配后8d12h,胚胎原肠呈球形,16d14h,原肠发育成管状,分前肠、中肠及后肠。胚长4～14mm,头侧5对鳃弓逐渐退化,口膜破裂与前肠相通,上下颌及舌已形成。感官及主要内分泌腺的原基也已发生。食道呈管状,胃芽由棱形变成椭圆形。分化出三室,背系膜中有脾芽发生。胚长4～5mm 时,前中后肠呈直管状,到6～9mm,肠襻似“V”字形;胚长10～15mm 时,“V”形肠襻以背系膜为中轴,顺时针旋转180°。胚胎发育到20d,前肠腹面的内胚层发生出1个肝憩室,到22d,肝芽内细胞索交织成网,其中形成静脉导管。到交配后30d,总胆管通向降肠起端。背胰芽发生于前肠背面的内胚层,腹胰芽发生于胆囊管后方的前肠腹面,腹胰芽从前肠右侧伸向背胰芽,合并为胰腺原基。从4mm 长胚胎开始,咽底面发生喉气管沟,进而形成喉气管芽,到胚长15mm,气管芽依次分支形成肺芽原基。