野禽新城疫病毒F和HN基因的遗传变异趋势

野禽携带的新城疫病毒是新城疫流行传播的重要的潜在传染源.结合本实验室克隆测序的鸽NDV(PB9601)、企鹅NDV(QE01)以及GenBank下载的44株野禽(包括野鸭、鹦鹉、鸽子、天鹅、鸳鸯、雁、火鸡等)的NDV毒株的融合蛋白(Fusion gene,F)基因和血凝素蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase gene,HN)基因分别进行了F蛋白裂解位点、基因分型以及F和HN基因氨基酸全长的遗传距离分析.结果表明:野禽感染NDV F基因的基因型以Ⅶ和Ⅵ为主,同时I、II、V和IX多种基因型并存.同一种属、同一地区的毒株间的遗传距离较近,具有明显的种属性和区域性,且绝大多数分离株与经典毒株LaSota、V4、B1、TEX-48等的遗传距离相对较远;对HN基因的遗传进化关系分析得出了相似的结论.     

野禽新城疫病毒F和HN基因的遗传变异趋势

野禽携带的新城疫病毒是新城疫流行传播的重要的潜在传染源。结合本实验室克隆测序的鸽NDV(PB9601)、企鹅NDV(QE01)以及GenBank下载的44株野禽(包括野鸭、鹦鹉、鸽子、天鹅、鸳鸯、雁、火鸡等)的NDV毒株的融合蛋白(Fusion gene,F)基因和血凝素蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase gene,HN)基因分别进行了F蛋白裂解位点、基因分型以及F和HN基因氨基酸全长的遗传距离分析。结果表明:野禽感染NDV F基因的基因型以Ⅶ和Ⅵ为主,同时Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ和Ⅸ多种基因型并存。同一种属、同一地区的毒株间的遗传距离较近,具有明显的种属性和区域性,且绝大多数分离株与经典毒株LaSota、V4、B1、TEX-48等的遗传距离相对较远;对HN基因的遗传进化关系分析得出了相似的结论。     

广东省新城疫病毒HN基因系统发育分析

用套式RT－PCR一步法扩增了九株NDV地方强毒的HN基因，并对其中3株的HN基因片段进行了克隆、测序及同源性分析。本试验还对该毒株的系统发育情况进行了分析：广东省NDV各毒株与欧美国家I至V基因群明显分离，遗传关系较远。台湾省NDVT各毒株归属为一组并且与中国大陆毒株的遗传距离较近。其中一支FS1／95株不能归类到任何一个基因群中。广东地区从鹅群中分离到的副黏病毒GPMV株与我们从鸡体中获得的NDV FS2株有相近的亲缘关系。     

辽宁省新城疫病毒F基因和HN基因的分子特征与致病性

采用RT-PCR对新城疫病毒辽宁分离株的F基因和HN基因进行扩增并测序,初步研究其分子特性分析和致病性。结果表明,分离株CY1株、DD2株、YK1株和TL4株的致死鸡胚平均时间(MDT)分别为50.6 h、76.3 h、62.9 h和81.3 h,CY1株具有强毒特征。F基因分型显示,CY1株属于Ⅶ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒氨基酸基序特征,与流行株js02株的亲缘关系非常近,与疫苗株LaSota、Queensland V4亲缘关系均较远。DD2株、YK1株和TL4株均属于基因Ⅱ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112GRQGRL117,符合NDV非强毒氨基酸基序特征,与LaSota株亲缘关系最近。本研究将为本省新城疫防制对策的制定提供参考。     

新城疫病毒地方分离株HN基因的克隆及遗传变异分析

对河北省保定地区两个NDV分离株用RT-PCR技术扩增其HN基因片断,产物经转化、克隆和测序,参照国内外已发表新城疫代表株绘制NDV系统发育进化树并分析其遗传关系,结果表明,两个分离株HN基因在遗传上同源性高达99.7%,两个分离株HN基因核苷酸序列与国内外报道的相关序列同源性为82.8%～93.2%,推导氨基酸序列同源性为90.0%～96.0%,由系统发育树可见,与现今流行于国内的Ⅶ型病毒株有密切联系.     

中国水禽新城疫病毒F和HN基因的变异趋势

选取中国1996-2005年的8株鹅、鸭等水禽NDV流行株,克隆其融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（HN）基因,参考GenBank中具有F和HN核苷酸全长的16株国内外NDV代表株、16株国内水禽流行株以及12株只具有F基因的水禽毒株序列,参照传统F基因分型方法,分别对F和HN基因进行分型,同时进行相关比较、核苷酸和氨基酸同源性以及系统发育分析。结果表明：16株国内外代表株F和HN基因分型基本一致,但24株水禽NDV流行株中只有15株相同,符合率为62.5%,不同占37.5%（9/24）。系统发育和同源比较发现：水禽NDV流行株HN基因高度同源,同属Ⅶ型,而F基因则分属不同的基因型。通过对24株NDVF和HN基因氨基酸全长以及进行F基因分型的F基因47-420位核苷酸的同源性相关性比较证实：F基因前47-420位核苷酸的遗传变异与F基因氨基酸全长变异密切相关,r=0.916,但与HN基因的氨基酸变异不相关,显示出NDV在演变过程中F和HN基因具有相对的独立性。水禽NDV是家禽NDV的重要储存宿主,应高度重视水禽NDV的变异。     

新城疫病毒F48E9株HN基因核苷酸序列

本研究采用 Ｓａｎｇｅｒ＇ｓ 双脱氧末端终止法测定了新城疫病毒国内标准强毒株 Ｆ４８ Ｅ９ 血凝素神经氨酸酶基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的核苷酸序列,推导出其氨基酸序列。 Ｆ４８ Ｅ９ Ｈ Ｎ 基因编码区全长为 １７１３ｂｐ,单一的开放阅读框编码５７１ 个氨基酸的糖蛋白。含有６ 个潜在的与天门冬酰胺（ Ｎ）连接的复合寡聚糖和高甘露糖寡聚糖结合位点,其中有 ５ 个簇集在蛋白分子的 Ｃ末端一半内,有１３ 个半胱氨酸残基。发现６ 个 Ｆ４８ Ｅ９ 特有的氨基酸残基,３７ 位 Ｆ（ Ｌ）、３８ 位 Ｓ（ Ａ）、６０ 位 Ｌ（ Ｐ）、１０５ 位 Ｓ（ Ｎ）、４４３ 位 Ａ（ Ｔ）、５７１ 位 Ｉ（ Ｖ）,这些位点除了 ６０ 位的 Ｐ有两株为 Ｓ以外,其它的在 １３ 株已知序列中均为高度保守序列。     

鸽源新城疫病毒的鉴定及HN基因遗传演化分析

根据发病鸽群的临床症状、病理剖检、组织病理学变化,并结合RT-PCR方法对武汉地区某鸽场疑似鸽新城疫进行了确诊,同时对分离的2株鸽源新城疫病毒(NDV)进行了HN基因结构特征及其与已知毒株的遗传相关性分析。结果表明:两株鸽源NDV分离株HN基因片段均含有6个保守的糖基化位点。2株NDV分离株HN基因序列与参考株同源性在80.0%~97.2%,与湖北株(AY225110.HB92)、印度株(KM056357.ndv61/B1)、江苏株(GQ245832.YC-24-07-CH)、陕西株(JF795531.HX01)在同一分支上,为基因II型。研究为武汉地区鸽新城疫的防控提供了理论依据。     

鹅源禽副粘病毒NA-1株HN蛋白基因的遗传变异研究

鹅副粘病毒分离株NA-1株经11日龄鸡胚增殖后纯化。提取病毒的基因组RNA，采用RT-PCR扩增出与预期设计的1．7kb大小相符合的特异条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体，经纯化、筛选及酶切鉴定后，初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆，并对阳性克隆进行了测序。测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1740bp，该基因的ORF总长为1716bp，编码571个氨基酸。与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列，发现所测NA-1株与国内标准强毒株F48E9核苷酸的同源性为84．5％，氨基酸的同源性为89．5％；与传统的疫苗株La Sota核苷酸的同源性为82．2％，氨基酸的同源性为88．5％；与鹅源禽副粘病毒SF02株核苷酸的同源性为97．1％，氨基酸的同源性为97．4％；与鹅源禽副粘病毒YG97株核苷酸的同源性为97．3％，氨基酸的同源性97．4％。说明NA-1株和SF02株、YG97株亲缘关系较近，它们三者可能有着共同的来源。根据基因树分析，NA-1株应属于基因VII型新城疫病毒。由此更进一步证实新城疫可以感染水禽，且对鹅具有高度的致死性。     

表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，用设计带有限制性酶切位点的特异地扩增子人起始密码子开始的１．８ｋｂ新城疫病毒（ＮＤＶ）血凝素－神经氨酸（ＨＮ）基因开放式阅读框（ＯＲＦ），然后插入ｐＴＫ２Ｂ的Ｎｂｅ１位点，构建了含ＮＤＶＨＮ基因的插入载体ＰＴＫＨＮ１和ＰＴＫＨＮ２，将其与感染火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）细胞的总ＤＮＡ共转民纤维细胞（ＣＥＦ），经有限稀释法和Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ筛选，得到含有ＨＮ基因的重组体ｒＨ     

新城疫病毒F基因重要功能区和HN基因单核苷酸多态性研究

对广泛应用的新城疫疫苗株La Sota进行了全基因组测序,并对来自9个不同基因型新城疫病毒株的血凝素神经氨酸酶(haemagglution-neuraminidase,HN)基因和融合蛋白(fusion protein,F)基因47～435 nt区域进行了用单核苷酸多态性(SNP)分析.结果表明:在F基因47～435nt间和HN基因中都存在高密度的SNP位点,Tajima's D检验结果表明这些核苷酸变化符合中性突变假说,Pi(a)/Pi(s)分析暗示F蛋白编码基因N端的一些区段和HN蛋白编码基因中散在的部分区域受到了正向选择.但F基因和HN基因在整体上却都受到了强大的负向选择压力的影响.     

麻鸡新城疫病毒SX-1株F和HN基因共表达蛋白的免疫原性

用PCR扩增麻鸡新城疫病毒SX-1株F基因和HN基因,并以由15个氨基酸构成的短肽为Linker将F及HN基因片段体外连接,与转座载体PFastBacⅠ连接,获得重组质粒PFastBacF—HN,并转化到DH10Bac宿主菌,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中,经筛选获得的重组Bacmid F—HN质粒转染Sf-9昆虫细胞,进行表达检测,表达产物间接免疫荧光试验阳性,经SDS—PAGE、Western-blot检测显示,获得相对分子质量约123000的蛋白特异条带,说明F-HN重组蛋白表达成功。将共表达蛋白进行进行动物试验,间接血凝试验表明雏鸡免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,共表达蛋白二次免疫雏鸡后,对NDV强毒的攻毒保护率为80％,这一结果提示利用FHN基因构建的亚单位疫苗具有重要的开发应用价值。     

新城疫病毒F48E9株MNPF和HN基因的真核表达

将新城疫病毒（NDV）F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体pCAGG上，经酶切、PCR鉴定和序列分析，分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒，命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGGHN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞，经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGGM、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG—HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48h后，可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明，NDVF48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达，同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。     

新城疫病毒F48E9株HN基因的克隆与酶切分析

为深入探讨新城疫病毒（ＮＤＶ）的结构与功能的关系，扩增和克隆了Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ的ＨＮ基因。首先以提取的Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ基因组ＲＮＡ为模板逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，然后用ＨＮ基因特异性引物作ＰＣＲ扩增ＨＮｃＤＮＡ，结果得到１条分子量约１．８ｋｂ的ＤＮＡ带，与ＮＤＶＨＮ基因的大小一致。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交进一步证实其为ＨＮ特异性ｃＤＮＡ。随后采用平端连接法将其克隆到ｐＳＶ·Ｓｐｏｒｔｌ质粒中，应用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳｃａⅠ、ＭｌｕⅠ、ＡｐａⅠ、ＰｓｔⅠ、和ＳｍａⅠ对ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮｃＤＮＡ重组质粒作单酶或双酶切，结果表明，ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮ基因较ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１株的ＨＮ基因缺少１个ＭｌｕⅠ位点（７０５ｂｐ左右），多１个ＰｓｔⅠ位点（８０２ｂｐ左右）。     

新城疫病毒HN基因与鸡贫血病病毒VP3基因对小鼠黑色素瘤的联合抑制效应

在 C57BL/6小鼠的左后肢肌肉注射脂质体包裹的含新城疫病毒 HN基因和鸡贫血病病毒 VP3基因的重组质粒。 2周后 ,在左后肢相同部位皮下接种 B16黑色素瘤细胞 2× 10 5个 ,致瘤 2、10 d后 ,分别肌注相同的重组质粒 .通过细胞毒 T淋巴细胞和自然杀伤细胞 (NK)以及小鼠血清中唾液酸含量的测定 ,探讨新城疫病毒抑瘤的机制以及新城疫病毒 HN基因与鸡贫血病病毒 VP3基因的协同抑瘤效应。结果表明 ,与对照组相比 ,注射含 HN基因和 VP3基因的重组质粒可使荷瘤鼠的肿瘤体积缩小。用新城疫病毒或含新城疫病毒 HN基因重组质粒治疗的荷瘤鼠 ,NK活性、CTL 活性明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,血清中唾液酸含量低于对照组 ,但差异均不显著 (P >0 .0 5 )。从而证明新城疫病毒 HN基因能够增强小鼠对移植瘤的免疫杀伤力 ,是新城疫病毒发挥抗肿瘤作用的主要功能性基因。     

基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

为制备基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)的单克隆抗体(MAb),本研究利用JS/17病毒株的HN重组蛋白和活病毒分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,并通过ELISA、间接免疫荧光和western blot方法筛选,制备了3株特异性识别HN蛋白的单克隆抗体(MAb)。其中,MAb1D4和4D9具有病毒中和活性(VN)及血凝抑制作用(HI),可以识别多种基因型的Ⅱ类NDV,但与Ⅰ类NDV病毒株无反应。MAb 2G8识别线性表位131DYIGGIGKE139,该表位在各病毒株中高度保守。获得的3株MAb可以用于NDV的鉴定及HN蛋白的功能研究。