苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白vip3A-LS1基因的克隆与表达

从土壤中分离得到营养期对鳞翅目害虫高毒的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)LS1菌株,分子检测该菌株中存在营养期杀虫蛋白基因,进行了该基因的克隆和表达。设计全长基因引物扩增得到了约2.3kb的靶片段,序列分析证实为新vip3A基因,命名为vip3A-LS1,GenBank登录号为DQ016968,Bt基因命名委员会命名为Vip3Aa22。该基因推导蛋白与其它已知同源蛋白有8个氨基酸不同。构建vip3A-LS1基因的表达载体,SDS-PAGE检测约88kD目的蛋白大量表达;生物测定表明,胞内可溶性蛋白对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)活性最高。纯化蛋白对初孵棉铃虫和甜菜夜蛾的LC50分别为73.6和32.2μg/g。     

转Lj-POLLUX和Lj-NFR1-NFR5基因的水稻对AM真菌侵染的影响

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza,AM)真菌是一种古老的植物共生真菌,与植物约有4亿多年的共生史[1-2],能与80％以上的陆生植物形成共生体一丛枝菌根.它能促进宿主植物吸收土壤中矿质元素,增加植物的抗逆性,提高作物产量,调节宿主的代谢活动,促进植物生长,改善作物品质等[3-4].     

转Cry1Ab/Ac基因水稻对稻田底栖动物群落的影响

转Bt基因抗虫水稻的成功研发,为有效控制鳞翅目害虫对水稻的危害提供了一条最为有效、经济的途径。稻田底栖动物群落是转Bt基因抗虫水稻的重要非靶标生物。为了解转Bt基因水稻对稻田底栖动物群落的安全性,以转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻‘华恢1号’(简写为HH1)为材料,以其非转基因亲本‘明恢63’(简写为MH63)为对照,以稻田底栖动物群落为指示生物,运用群落学方法,通过连续2年在江西南昌的大田试验,研究了转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻对稻田底栖动物群落的影响。结果显示:2012年在HH1与MH63的稻田中分别采集到底栖动物22种与25种,其中两生境中相同物种19种,两群落物种组成相似度为0.808 5,有7种优势种,优势种相似度为0.833 3。2013年在HH1与MH63稻田中分别采集到底栖动物26种与28种,两类稻田相同底栖动物22种,两群落物种组成相似度为0.814 8,有6种优势种,优势种相似度为1.000 0。2012年与2013年群落总体分析与时间动态分析均显示,两类稻田中底栖动物的物种丰富度、个体数量、多样性指数、均匀性指数及优势集中性指数变化趋势相似,且均无显著差异。结果表明:连续种植2年转Cry1Ab/Ac基因水稻HH1对南昌稻田底栖动物群落无明显的负作用。     

水稻10kD醇溶蛋白基因表达双元质粒的构建及其对烟草的遗传转化

将高含硫水稻１０ｋＤ醇溶蛋白基因从质粒ｐＦＭ１８亚克隆到植物高效表达载体卡盒ｐＲＳ１００中，得到双元表达质粒ｐＲＳ１０Ｋ；对其进行ＰＣＲ扩增及ＰＣＲ产物酶切分析，表明ｐＲＳ１０Ｋ包含来自ｐＲＳ１００的ｒｂｃＳ高效表达启动子、终止子和Ｍ１３通用引物互补序列及水稻１０ｋＤ醇溶蛋白基因。将ｐＲＳ１０Ｋ通过农杆菌感染法转化烟草，并对烟草转化植株进行ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果证明ｐＲＳ１０Ｋ的Ｒ     

嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP）的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究

为确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)AS1.927株外膜蛋白(OMP)的原核表达产物是否具有抗原性及其对小鼠的免疫保护力.本研究根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计1对引物,克隆出ompA全长基因1020 bp(GenBank登录号:EU309491),经Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后连接pET-30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia cDli)BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定.结果显示重组基因工程菌E.coli[pET-30a-ompA]表达的融合蛋白分子量约为40.7kD,可以被鼠抗嗜水气单胞菌外膜蛋白抗血清识别.将重组基因工程菌Ecoli[pET-30a-om-pA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus mussulus);末次免疫1周后用放射免疫分析小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平,检测结果揭示,该重组基因工程菌能提高sIgA的分泌(P<0.05);同时在小鼠血清中测出特异性抗体IgG(P<0.05).末次免疫2周后用100 LD50的Ah AS1.927(3.3×105> cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为75%,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.     

干旱条件下DCMU对高表达转C4-pepc水稻的花青素合成基因及其相关信号的影响

为了揭示高表达转玉米C4-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,EC 4.1.1.31)基因水稻(PC)在耐旱中光合与花青素调节途径的内在联系,本研究以PC和未转基因野生型原种(WT)的水培苗为试验材料,在4~5叶期,通过50μmol·L-1光合抑制剂DCMU[3-(3’,4’-dich-lorophenyl)-1,1-dimethyl-urea]预处理1 h,观察其在12%PEG-6000模拟干旱处理下的表现。结果表明,在模拟干旱条件下,DCMU预处理使两种供试材料相对含水量显著下降,且PC相对含量显著高于WT;干旱处理下,两种材料的花青素含量显著升高,DCMU和干旱处理使两种材料的花青素含量下调,且PC水稻中始终伴随着较高的花青素含量。光合数据表明,与单独12%PEG-6000处理相比,DCMU联合12%PEG-6000处理显著抑制了两种水稻材料的净光合速率、气孔导度、胞间CO2含量及羧化效率,但PC的各指标显著高于WT。同时,DCMU联合12%PEG-6000处理显著下调两种供试材料的内源蔗糖含量,但PC中蔗糖含量显著高于WT。进一步研究发现PC中更高的蔗糖含量与花青素合成有关转录因子b HLH(Os B1,Os B2)、R2R3-MYB(Os C1)、COP1(constitutively photomorphogenic 1)、HY5(elongated hypocotyl 5)更高的转录水平同步,下游花青素合成相关基因Os PAL、Os CHI、Os CHS、Os F3H、Os F3’H、Os DFR、Os ANS的表达量增加。PC水稻可能通过诱导NO和Ca2(10)感受干旱信号,参与转录因子的调节,进而参与花青素合成基因的调控,合成较多的花青素,增强PC水稻对干旱逆境的响应,增强保水能力,最终表现耐旱。     

PR结构域蛋白1(PRDM1)慢病毒表达载体的构建及其对脐带间充质干细胞(hUC-MSC)向生殖细胞诱导分化的影响

PR结构域蛋白1基因(PR domain containing 1,with ZNF domain,PRDM1)作为原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC)形成过程中的一个重要起始因子,在胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向PGC的发育分化过程中发挥重要作用。为了研究其在成体干细胞诱导分化中的作用,本研究PCR克隆获得小鼠(Mus musculus)PRDM1基因(GenBank登录号:JX154081.1),构建了PRDM1慢病毒表达载体pCDH-PRDM1,通过293T细胞包装病毒,用携带有PRDM1基因的病毒颗粒转导脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)。结果表明,PRDM1基因成功在hUC-MSC中超表达;PRDM1基因能引起生殖相关基因胚胎特定时期抗原-1(stage-specific embryonic antigen-1,SSEA-1)、多能性相关蛋白3(developmental pluripotency associated 3 Dppa3,STELLA)、干细胞生长因子受体(stem cell growth factor receptor,C-KIT)和性别决定基因-同源盒2(sex determining region Y-box 2,SOX2)的上调,为进一步研究该基因的功能和提高干细胞向生殖细胞诱导分化研究奠定了一定的基础,并且为hUCMSC向生殖细胞的诱导分化提供了一个新的思路。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白(OMP)在乳酸乳球菌中的表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护效果

乳酸球菌(Lactococcus lactis)是一种安全级微生物,为活载体疫苗传递抗原的理想选择.嗜水气单胞菌(A eromonas hydrophila,Ah)能引起鱼类等多种动物的败血病,因其血清型众多,寻找共同保护性抗原是进行疫苗研究的重点.为探究嗜水气单胞菌AS1.927株外膜蛋白(OMP)在乳酸乳球菌中的表达和检测其表达产物对小鼠的免疫保护效果,本研究将己克隆的ompA基因经BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后连接载体pNZ8048,转化乳酸乳球菌NZ9000,nisin诱导表达,并进行SDS-PAGE分析鉴定.结果显示,重组基因工程菌L.lactis[pNZ-ompA]表达的融合蛋白分子量约为36.2 kD,成熟蛋白分子量约为33.7 kD.将重组基因工程菌L.lac tis [pNZ-ompA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),用放射免疫法检测末次免疫一周后的各组小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的水平以及用间接ELISA法检测小鼠血清特异性抗体IgG,结果发现,该重组基因工程菌能显著提高sIgA的分泌(P＜0.05);同时在小鼠血清中的特异性抗体含量也显著高于对照组(P＜0.05).末次免疫两周后用100 LD50的Ah AS 1.927(3.3×105 cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为87.5％,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.该结果将为开发安全有效的口服基因工程鱼用疫苗提供一定的实验基础.     

不同发育时期转基因高粱不同株系Cry1Ab蛋白含量的比较

高粱的害虫种类众多,影响着产量与品质,培育抗虫品种是重要的育种目标,但目前高粱中缺乏有效的抗螟虫资源,难以通过常规育种培育出抗螟虫的品种。张明洲(2002)成功地将来自Bt密码子优化的抗虫基因cry1Ab转入高粱中,并经农业部批准进入中间试验阶段。为有效和合理地利用这一抗虫     

转Cry1Ac和Cry1A+CpTI基因棉花粉对柞蚕生长发育影响的评价*

柞蚕(Antheraea pemyi)是中国华北和东北地区大面积人工野外饲养的重要经济昆虫,以天然柞林形成的蚕场与棉花常处于同一生态系统中。采用田间花粉沉积量测定结合室内生物测定的方法评价了转Cry1Ac基因和Cry1A CpTI基因棉(Gossypium hirsutum)花粉对柞蚕生长发育的生态风险。花粉沉积量测定表明,棉田内1m至棉田外1m的范围内,棉花花粉5d累积密度低于200粒／cm^2。用转基因抗虫棉花粉处理(花粉密度约l000粒／cm^2和10000粒／cm^2)的辽东栎(Quercus liaotungensis)叶片分别饲养蚁蚕至3龄末,结果显示,与非转基因棉花粉处理相比1～3龄期柞蚕的死亡率、发育历期、以及食物利用率、食物转化率、相对代谢速率、相对取食量和近似消化率等营养指标均无显著差别。表明两种供试转基因抗虫棉的种植不会对柞蚕的生长发育带来显著不利影响。     

Persistence of Cry1Ac Protein from Transgenic Bt Cotton Cultivation and Residue Returning in Fields and Its Effect on Functional Diversity of Soil Microbial Communities

The persistence of Cry1Ac protein in the soil and its effect on soil microbial communities are a core issue in assessing the ecological risk of transgenic Bacillus thuringiensis (Bt) cotton. In this study a field experiment was conducted on the cultivation of transgenic Bt cotton (Jin 26 and BtJi 668) with the immediate returning of residues to the fields, in order to quantify the Cry1Ac protein content in the fields and investigate its effects on the functional diversity of soil microbial communities. Cry1Ac protein in the residue-soil mixture was gradually degraded in the transgenic Bt cotton fields. After transgenic Bt cotton straw was returned to the fields for 30 d, 63.73% and 58.33% of the initial amounts of Cry1Ac protein were degraded in the Jin 26 and BtJi 668 fields, respectively. Before the crops were sown in the following year (180 d after returning the straw), no Cry1Ac protein was detected in the fields. After returning the cotton straw to the fields for 30 d, the Shannon-Wiener and McIntosh indices of soil microbial communities in the transgenic Bt cotton fields were significantly higher than those in the non-transgenic cotton fields. Meanwhile, the utilization of carbon sources including amino acids, amines, and carbohydrates by the soil microbial communities significantly increased. Both the McIntosh index and the utilization of carbohydrates increased until 180 d. Principal component analysis revealed that amino acids, amides, and carbohydrates were the main carbon sources distinguishing the two principal component factors. These findings indicated that Cry1Ac protein did not accumulate in the fields after transgenic Bt cotton was planted for one year and the residues were immediately returned to the fields; however, the original functional diversity of soil microbial communities was affected continuously.     

转基因高粱Cry1Ab蛋白含量的比较研究

通过农杆菌介导法将杀虫晶体蛋白基因cry1Ab导入高粱恢复系115中,共获得13个独立的转基因株系,26株转基因植株,转化率为5.1%;GUS活性、PCR、Southern和Western杂交分析表明,此基因已整合进高粱基因组并得到正确表达。利用ELISA试剂盒测定Cry1Ab蛋白含量,结果表明,不同转基因植株的Cry1Ab蛋白含量有明显差异,最高可达0.850 μg/g,占可溶性蛋白的0.016%,还有一些转基因植株中不能表达;同一转基因植株的不同组织中表达量有明显差异,其顺序为：叶>颖壳>籽粒>根>茎;不同部位的叶片也有差异,其顺序为：中部叶>基部叶>新叶。     

转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的检测及其表达特征研究

为了建立转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的免疫学检测方法,并了解其在水稻生长过程中的表达特征,本研究在大肠杆菌中表达了CP4-EPSPS蛋白质,纯化后以其为免疫原免疫小鼠,经筛选获得了可识别CP4-EPSPS的单克隆抗体。建立了用免疫印记技术检测转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的方法,该方法可以从单粒稻米的0.63%材料中检测到CP4-EPSPS信号。对水稻不同发育时期代表性组织的检测结果表明,CP4-EPSPS蛋白质呈组成型表达,在花药、穗轴、颖壳及不同时期的叶片中的表达量较高,但在分蘖期基部茎节、叶鞘及成熟期种子胚中的表达量稍低。本研究建立的免疫学方法在转基因水稻检测中具有潜在的应用价值。     

华北地区转Cry1A+CpTI和Cry1A基因棉棉田害虫和天敌昆虫的群落结构*

2000～2001年采用背负式机动吸虫器取样法研究了转抗虫基因棉,双价(Cry1A十CpTI)转基因棉(SGK321)和Bt(Cry1A)棉(GK12),棉田的害虫和天敌群落结构。结果表明,从害虫群落组成上看,转抗虫基因棉田平均查得15科19种,从普通棉不施药和施药对照田平均分别查得14科17．5种和13．5科17．5种;转抗虫基因棉田的主要种类数量多于普通棉不施药和施药对照田,普通棉施药田主要优势种类为烟粉虱(Bemisia tabaci)和棉蚜(Aphis gossypii)2种;转抗虫基因棉田的绿盲蝽(Lygus lucorum)高于普通棉不施药和施药对照田,棉铃虫(Helicovcrpa armigera)是普通棉不施药对照田的常见种,转抗虫基因棉田则无。从天敌群落组成上来看,从转抗虫基因棉田共查得平均24．3科39.3种,从普通棉不施药和施药对照田平均分别查得24科43．5种和25科38种;微小花蝽、姬小蜂(Chrysonotomyia)和异须盲蝽(Cumpylomms diversicornis)为转基因棉和普通棉不施药对照的优势种,蜘蛛(Araneida)的优势度有所上升并成为丰盛种;而在普通棉施药处理田中,棉短瘤蚜茧蜂(Trioxys rietscheli)和龟纹瓢虫(Propylaea japonica)为优势种,寄生蚜虫跳小蜂(Aphidencyrtus shikokians)、棉短瘤蚜茧蜂(Trioxys rietschcli)和黄足蚜小蜂(Aphelinus flavipes)数量有所上升,成为丰盛种。相比而言,转抗虫基因棉田害虫和天敌的主要种类数量都明显多于普通棉施药田,表明转抗虫基因棉有利于保护棉田的生物多样性和棉田生态系统的管理。     

转GFM Cry1A基因玉米自交系及其杂交种的抗螟性鉴定

对获得的6个转GFM Cry1A基因玉米(zea mays)株系的T5代PCR分析证明,转基因株系是稳定遗传的.以此抗虫系为亲本与常规自交系配制了四密25Bt、通单24Bt和吉单209Bt3个杂交种.转基因自交系和杂交种的抗螟性鉴定结果表明:转基因系间抗虫性差异极显著,同一转基因系单株间也存在差异.抗螟性强的4个株系比受体对照平均蛀孔数减少70%、茎秆虫孔隧道长度减少80%、存活的虫体长度减少70%,差异显著,达到了高抗水平.对6个转基因抗虫系进ELISA检测,毒蛋白表达量平均占总蛋白0.16%,最高的达0.19%.杂交组合四密25Bt、通单24Bt和吉单209Bt群体内平均虫孔隧道长度与常规杂交种对照相比,分别减少39.97%、36.2%和53.83%,平均减少43.36%,抗虫性明显提高.农艺性状鉴定结果显示,转基因系配制的杂交种与对照在株高、穗长、穗行数、行粒数和百粒重上无显著差异.研究认为,Bt基因可用于玉米的抗螟性改良,为转基因抗虫玉米自交系能够直接用于玉米杂交种改良提供了依据.     

Changes in Germination and Physiochemical Properties of Transgenic cry1Ab/cry1Ac Gene Rice During Long‐Term Storage

The changes in germination, free fatty acid (FFA), and viscosity of the transgenic Bacillus thuringiensis (Bt) rice expressing the cry1Ab/cry1Ac gene and its associated Bt protein were observed at three‐month intervals during 24 months of storage at ambient temperature and relative humidity. After nine months of storage, FFA of transgenic Bt rice was significantly lower than that of nontransgenic rice, while germination was significantly higher. Rates of change of FFA and germination in transgenic rice were lower than in nontransgenic rice. The content of Bt protein in the husk and in the brown rice both decreased 80% during 24 months of storage. Our observations suggest that transgenic Bt rice used in this study had long‐term storability.     

Mineralization of the Bacillus thuringiensis Cry1Ac endotoxin in soil

Although a number of studies have been done describing the fate of Bacillus thuringiensis insecticidal endotoxins in soil, there is conflicting information on the persistence of this class of insecticidal toxins. This is partly due to methodological limitations in many of the previous studies. In the experiments reported here, 14C-labeled B. thuringiensis Cry1Ac endotoxin was used to study its mineralization in soil incubated under controlled conditions. Fifty-nine percent of the radiolabeled Cry1Ac was recovered as 14CO2 at the end of the 20 day incubation period. The addition of 4.5% corn residues stimulated mineralization of [14C]Cry1Ac toxin, and mineralization of glucose was 3.6 times faster than that of the Cry1Ac toxin, indicating that the soil was microbiologically and metabolically active. Because only low mineralization (approximately 6%) of the radiolabeled toxin was observed in autoclaved soil, the current findings indicate that microbial processes play a major role in the dissipation of the Cry1Ac endotoxin in soil. The results of this study suggest that there may be limited risk of the bioaccumulation of Cry1Ac in soil due to the eventual release of this insecticidal toxin by Bt-protected crops.     

不同条件育秧提高水稻秧苗抗逆性的研究

稻麦轮作系统中,麦秸还田腐解产生的有毒有害物质可对下茬水稻幼苗产生不利影响,有效减缓或避免其负面影响对于水稻生产尤为重要,而筛选能够提高水稻秧苗抗性的育秧技术不失为重要途径。通过采用5种不同育秧条件对水稻秧苗进行抗性锻炼,以期提高水稻秧苗对麦秸还田条件的抗逆性和适应性,并在移栽后采取相同的栽培措施(氮素和水肥管理)对其进行评估。试验结果表明,干旱及低营养条件下育秧均降低了水稻株高、生物量以及叶绿素含量,且增加了水稻植株丙二醛含量和脯氨酸含量,使水稻的生长发育受到抑制;而施用秸秆、浇施秸秆腐解液以及酚酸混合液进行育秧的处理均增加了水稻株高、地上部鲜重、叶绿素含量、总根长、根表面积、根体积、根尖数、根分枝数和平均根直径,且均降低了水稻植株丙二醛含量和脯氨酸含量,提高了水稻秧苗对麦秸腐解产生负面影响的抗逆性和适应性。通过在水稻育秧期添加适量麦秸、麦秸腐解液或酚酸混合液均可有效提高水稻秧苗对麦秸还田条件的适应性。