应用二次通用旋转组合设计优化黄绿绿僵菌固相培养基配方

在真菌孢子粉大规模生产中,筛选生防真菌最佳产孢培养基是提高产孢量的先决条件。选用廉价易得的实验材料作固体培养基,在单因素试验的基础上,采用二次通用旋转组合设计,对影响黄绿绿僵菌Mf82菌株固相发酵阶段产孢量的固体培养基组分及其配比进行了优化,并检测了所获孢子粉的质量指标。结果表明,单因素试验,从大米粉、面粉、玉米粉、豆角壳和黄粉虫蜕中选择面粉、豆角壳与黄粉虫蜕以4:1:0.2配比混合作为固体培养基配方时,该菌产孢量最高;优化实验,固相培养基中面粉、豆角壳和黄粉虫蜕的配比为4:1:0.25时,该菌产孢量高达2.39×10¹²个·kg^-1;孢子粉的指标检测,显示用该培养基配方生产的黄绿绿僵菌孢子粉达到了真菌孢子粉生产的企业标准。     

广东省森林昆虫病原真菌调查

2003--2004年,对广东省森林昆虫病原真菌进行了调查,共分离鉴定出9种昆虫病原真菌：即灯蛾噬虫霉、蝗噬虫霉、紫色野村菌、莱氏野村菌、玫烟色拟青霉、粉虱座壳孢、黄绿绿僵菌、球孢白僵菌和卵孢白僵菌。其中：球孢白僵菌是森林昆虫的优势病原真菌,灯蛾噬虫霉、蝗噬虫霉和紫色野村菌是广东省新记录种。     

黄绿绿僵菌Ma130821菌株的分子鉴定及产孢特性研究

【目的】鉴定从云南省玉溪市峨山县塔甸镇玉米田自然罹病蛴螬分离培养获得的绿僵菌Ma130821种类,明确该菌株在害虫生防制剂开发应用的潜力。【方法】根据微生物菌落培养特征和产孢结构特征,结合ITS-5.8S DNA序列,对绿僵菌Ma130821进行种类鉴定,同时对其产孢特性进行研究。【结果】绿僵菌Ma130821为黄绿绿僵菌(Metarhizium flavoviride),该菌株Ma130821在大米、麦麸、玉米粒和稻壳基质上固相培养后均能生长和产孢,但产孢量不同。其中在大米基质上,黄绿绿僵菌的每克孢子含孢量和每克基质产孢数均为最高,同时所产孢子萌发率极显著高于其他培养基所产孢子(P0.01),由此以大米为基质,系统研究了黄绿绿僵菌Ma130821菌株的产孢特性。发现在25℃条件下,黄绿绿僵菌在大米基质上每克孢子含孢量最高达到1.47×109个,极显著高于28℃和30℃(P0.01),所产孢子在48 h时的萌发率达到100%;16 L∶8D光照条件下每克孢子粉产孢量高达5.07×108个,极显著高于14 L∶10 D光照条件下的产孢量,在第48小时时,16 L∶8 D条件下所产孢子的萌发率达到100%。【结论】从云南省玉溪市峨山县塔甸镇玉米田自然罹病蛴螬分离培养获得绿僵菌Ma130821为黄绿绿僵菌(M. flavoviride)。以大米为固相产孢基质,在25℃、16 L∶8D的培养条件下最适宜该菌株分生孢子扩大培养。     

綠僵菌、黄僵菌对松毛虫的室内杀虫及固体生产试验初报

自国外引入金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae1株(RS455)和黄僵菌(即粉质拟青霉)Paecilomyces farinosus 2株(RS3、RS20),经室内杀虫试验证明,皆侵染马尾松毛虫,其中RS3致病力较强,RS455次之。在相对湿度33—97%的范围内,RS455发芽率远高于2株黄僵菌,而RS3发芽率随相对湿度下降速度较RS20稍慢,抗旱力稍强。采用常规的固体生产技术成功地生产出这两种真菌。棉籽粉具显著的促产孢作用,稻壳具显著的改善通气作用。在浅盘生产中,RS455高压灭菌产孢量同石灰水抑菌相近,而RS3高压灭菌产孢量显著高于石灰水抑菌。     

绿僵菌MaZPTR-01菌株固体发酵条件筛选研究

以绿僵菌MaZPTR-01菌株为发酵菌株,进行最佳固体发酵培养基、不同加水量及加水顺序筛选,培养基不同厚度对产孢的影响,以及测定固体发酵过程中的温度变化等试验。结果表明:不同培养基组分及配比对绿僵菌的产孢量影响均极为显著,绿僵菌MaZPTR-01菌株的最佳固体发酵培养基配比为A1B3C1D3,即V(玉米粉)∶V(麦麸)∶V(米粉)∶V(谷壳)=1∶3∶1∶3;固体培养基加水后灭菌的处理绿僵菌产孢量显著较先灭菌后加无菌水的处理要高;每500 g固体培养基加水400 m L混合后灭菌的物理状态好、产孢量最高,固体培养基厚度以5 cm培养效果最好;通过测定绿僵菌固体发酵过程中的温度变化与对绿僵菌生长情况的观察,发现0~24 h为生长延滞期,24~48 h为对数生长期,48~96 h为生长稳定期,之后为生长衰退期(产孢阶段)。     

黄绿绿僵菌SM076菌株生物学特性研究

昆虫病原真菌是一类重要的害虫生物防治制剂,利用其防控农业与林业生产中的重大害虫,逐步减少传统化学药剂的使用,是今后农林害虫可持续治理的发展方向.对分离筛选得到的黄绿绿僵菌菌株SM076,在实验室条件下研究了培养基种类及温度对其生物学特性的影响.研究结果表明,不同培养基组成、不同温度对菌株SM076的菌落生长速度、产孢量、孢子萌发率等都有较大的影响.其中20～29℃为菌株SM076的最适培养温区,26℃为该菌株最佳培养温度;PDA和Czapek培养基都非常适合菌株产孢,同时在PDA培养基上该菌株生长速度最快.综合数据表明,黄绿绿僵菌SM076菌株是一株优良的生防菌株.     

金龟子绿僵菌的液固双相发酵研究

金龟子绿僵菌是重要的害虫致病真菌,采用液固双相发酵方法对MA4-37菌株进行发酵,研究液体培养基、固体培养基及其厚度、浅盘固体发酵、袋装固体发酵对金龟子绿僵菌生长及产孢量的影响,优化控制发酵过程。结果表明,液体发酵较适合的培养基为发酵液B(大豆1%、蔗糖1%、NaCl0.5%、MnSO40.5%,用KH2PO4-K2HPO4缓冲液调节pH值为6.0～7.0),采用该培养基时液生分生孢子产量和菌丝生长量均最高,分别达到4.3×109个/L、5.99g/L。固体发酵时,浅盘发酵方法优于袋装发酵,其中采用配方F的固体培养基(碎米600g、大米300g、H2O 50%、KH2PO4-K2HPO4缓冲液0.05%、蔗糖0.5%),厚度在1.3cm时,浅盘培养7d的产粉量可达16.1mg/g。     

黄粉虫虫粉对球孢白僵菌孢子粉产量、质量及其毒力的影响

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)在营养贫乏的培养基质上,菌株易发生退化,为保持高毒力优良菌株的稳定性,采用固液双相法生产球孢白僵菌分生孢子粉,在大米固态培养基中加入不同剂量的黄粉虫虫粉,研究添加虫粉对孢子粉产量、质量及其对大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)毒力的影响。结果表明,添加虫粉对球孢白僵菌的产粉量具有明显的促进作用,其中5.0+处理组的产粉量达到46.88 mg/g;添加虫粉对孢子粉活孢率无显著影响,但各处理组间的萌发速率不同,其中5.0+处理组的孢子萌发率达到50%、90%所需的时间分别为13.86、20.77 h,明显短于对照组。5.0+处理组的孢子粉对大豆食心虫毒力最高,接种后第10天的校正死亡率达到98.27%,侵染率为96.67%,致死中时(lethal time of 50%,简称LT50)为5.58 d。说明添加虫粉可以明显提高大米固态发酵生产球孢白僵菌的孢子粉产量和质量,有利于保持高毒力优良菌株的稳定性。     

黄绿绿僵菌侵染褐飞虱的电镜观察

利用扫描电镜与半薄切片结合的方式观察黄绿绿僵菌(Metarhizium flavoviride)对褐飞虱[Nilaparvata lugens (Stål)]虫体、卵块的侵染过程,并比较黄绿绿僵菌处理不同时长对褐飞虱卵块孵化率,及成虫、幼虫发育历期的影响。结果表明:黄绿绿僵菌在寄主褐飞虱体表不同结构区的入侵行为存在差异,易先从节间膜、体表的褶皱凹陷等部位产生附着胞,在体表长出菌丝和产孢,随后入侵寄主血腔,借助寄主的营养快速繁殖,导致菌体大量堆积在褐飞虱腹部引发其死亡。喷施于稻株表面的黄绿绿僵菌无法侵染产于稻株叶鞘组织内的褐飞虱卵块,但黄绿绿僵菌菌体可在离体褐飞虱卵块体表定殖并繁殖。黄绿绿僵菌处理褐飞虱种群的卵块孵化率集中在61.10%~72.67%,延长处理时间并未使寄主褐飞虱的卵块孵化率降低。不同处理时间的褐飞虱成虫、若虫历期与对照种群相比并无显著差异,说明黄绿绿僵菌处理并未对褐飞虱成虫、若虫发育历期造成影响。推测黄绿绿僵菌可侵染褐飞虱及其卵块,但所需时间较长,易受外界因子影响。因此,黄绿绿僵菌对褐飞虱的田间防控需结合外界影响因子制定合理的使用策略。     

白僵菌培养料的筛选

白僵菌三级固体培养料的试验结果证明:营养成份和透气性配比适宜,产孢量高于对照。对照麦麸100％每克菌粉含孢量为159.4亿个,(玉米(米查)每克菌粉含30.30亿个),而麦麸:锯末:稻壳比例70:20:10,每克菌粉含孢量高于对照108.70亿个,麦麸:锯末比例80:20,每克菌粉含孢量高于对照94.20亿个,麦麸:粉碎稻壳比例80:20,每克菌粉含孢量高于对照76.30亿个,麦麸:粉碎稻壳比例50:50每克菌粉含孢量高于对照43.40亿个。但在麦麸缺少地区可用玉米粒粉:粉碎稻壳比例60:40产孢量高,均可推广应用。     

用立式多层产孢箱同步生产多株生防真菌孢子粉

利用自主研制的一台立式多层产孢箱作为固相发酵产孢装置，对2株金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）、1株金龟子绿僵菌金龟子变种（Manisopliae var．anisopliae）和2株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）同时进行了高纯度孢子粉生产的产能试验。每菌株接种6kg大米基质，等量分置于产孢箱的3层中，于25℃下发酵6d。在5株供试菌中，球孢白僵菌Bb2860菌株的产孢量最高，达到2．2×10^12个孢子/kg大米，表现出优异的工艺性状和商品菌剂开发潜力。     

粉拟青霉三级固体培养料的选优

本文记述了粉拟青霉（ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｆａｒｉｎｏｓｕｓ（Ｈｏｉｍ　ｅｔＳ．Ｆ．Ｇｒｏｇ）ＢｒｏｗｎｅｔＳｍｉｔｈ）在五种不同固体培养料上进行三级扩大培养时的培养性状，并根据其产孢量的测定结果，判断以棉子壳和牛粪为主的两类固体培养料为优良培养基，该菌在这两种培养基上培养容易，产孢量大；这两种培养基原料易得，经济实用，易于推广。     

哈茨木霉M-17固体发酵及发酵产物浸提液对镰刀菌的抑制作用

通过平板对峙试验测定哈茨木霉M-17对尖孢镰刀菌、接骨木镰刀菌、木贼镰刀菌、茄病镰刀菌和锐顶镰刀菌的抑制作用;通过抑菌试验测定菌株M-17在添加中药残渣固体培养基中发酵产物浸提液的抑菌作用,筛选对5种供试病原真菌具有抑菌作用的固体发酵培养基配方。结果表明：哈茨木霉M-17对尖孢镰刀菌、接骨木镰刀菌、木贼镰刀菌、茄病镰刀菌和锐顶镰刀菌的菌丝生长抑制率分别为66.39%、66.18%、  57.06%、66.38%和51.29%;在添加中药渣固体发酵培养基上,菌株M-17的发酵产物浸提液对不同病原菌的抑制作用不同,其中配方为甘草∶玉米粉∶木屑的固体培养基对多种病原真菌具有较强抑制作用,配比为5∶4∶1时,M-17发酵产物浸提液对木贼镰刀菌的抑制率最高,为76.89%;配比为3∶5∶2时,对木贼镰刀菌和尖孢镰刀菌的抑制率最高,分别为78.45%和72.20%;配比为7∶2∶1时,对木贼镰刀菌的抑制率最高,为77.19%;配方为板蓝根∶玉米粉∶木屑、配比为3∶5∶2时,M-17发酵产物浸提液对木贼镰刀菌的抑制率最高,为77.99%。不同固体发酵培养基和配方影响木霉M-17发酵产物对不同镰刀菌的抑菌作用,为木霉菌制剂开发和应用提供了基础。     

云南澜沧县思茅松林虫生真菌多样性研究

【目的】探究云南澜沧县思茅松林虫生真菌多样性组成，为进一步开发、利用和保护思茅松林虫生真菌资源提供理论依据。【方法】 2019—2020年，采用踏查法对云南省澜沧县思茅松林内被虫生真菌感染的罹病虫体进行采集，采用划线法和弹射法对虫生真菌进行分离培养，结合形态学方法对虫生真菌进行种类鉴定。【结果】从物种组成看，云南省澜沧县思茅松林虫生真菌有5属9种，分别为白僵菌属球孢白僵菌和布氏白僵菌、绿僵菌属黄绿绿僵菌和金龟子绿僵菌、棒束孢属细脚棒束孢和环链棒束孢、虫草属高雄山虫草、线虫草属下垂虫草和蜂头虫草，其中球孢白僵菌和细脚棒束孢为优势种，相对多度分别为44.09%和33.33%。从物种多样性分析来看，澜沧县思茅松林下虫生真菌物种多样性丰富，分布均匀，垂直地带分布特征明显。从侵染寄主昆虫种类看，球孢白僵菌的寄主范围最广，共16种，其中鞘翅目昆虫占侵染个体总数的41.46%，叶甲被侵染的数量最多，占29.27%；细脚棒束孢和环链棒束孢的侵染寄主主要为松毛虫和鳞翅目蛹，其中细脚棒束孢的侵染寄主中鳞翅目蛹数量最多，占58.06%；白僵菌、棒束孢和高雄山虫草均可感染松毛虫，白僵菌和绿僵菌均可感染金龟子和膜翅目蚁科。【结论】云南澜沧县思茅松林虫生真菌物种多样性丰富，优势种为球孢白僵菌和细脚棒束孢，在松林害虫生物防治中具有良好潜力，应加强对球孢白僵菌和细脚棒束孢的保护和利用。     

粘帚霉固体培养基筛选

试验研究了GW-1-1,HL-2-1,GJ-1-1等3个不同来源的粘帚霉菌株在6种不同固体培养基上的培养性状和产孢量。结果表明:3个菌株在6种固体培养基上均能正常生长,但其产孢量差异显著。在以棉籽壳、麸皮、豆饼为原料的B配方培养基上,3个菌株都能良好生长,而且产孢量大,其中HL-2-1产孢量为8.27×108个/g,GW-1-1产孢量为6.98×108个/g,GJ-1-1产孢量为5.38×108个/g。该固体培养基原料来源广泛,价格低廉,易于推广,可作为粘帚菌的优良固体培养基。     

3种丝孢虫生真菌对西花蓟马成虫的毒力测定

[目的]测定3种丝孢类虫生真菌对西花蓟马[Frankliniella occidentalis(Pergande)]成虫的毒力,为筛选出对西花蓟马成虫高毒力的虫生真菌及生物防治提供依据.[方法]采用浸渍法在室内测定3种丝孢虫生真菌(球孢白僵菌、黄绿绿僵菌和玫烟色棒束孢)共14株菌株对西花蓟马成虫的侵染致死率;从3种丝孢虫生真菌中选取对西花蓟马成虫相对致病力较好的高毒力菌株各1株,测定其在不同浓度(浓度梯度分别为1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108孢子/mL)下对西花蓟马成虫的毒力.[结果]用1.0×107孢子/mL的球孢白僵菌菌株(WSWM81832、WSWL21831、WSWM1018315、WSWH21833和WSWL21836)、黄绿绿僵菌菌株(HLT17103、NGS21751、YKZ51712和WSWL51721)和玫烟色棒束孢菌株(WSWH31836、WSWL51831、WTS101822、NGS118310和WSWL21837)接种西花蓟马成虫10 d后,西花蓟马成虫的累积校正死亡率分别为68.45%~75.60%、67.35%~82.65%和61.45%~70.67%.球孢白僵菌WSWL21836、黄绿绿僵菌WSWL51721和玫烟色棒束孢WSWL21837菌株以1.0×104~1.0×108孢子/mL的孢子悬浮液接种西花蓟马成虫后,第10 d时西花蓟马成虫的累积校正死亡率分别为56.67%~82.33%、56.67%~89.67%和48.33%~76.67%;各菌株的毒力回归方程分别为Y=3.2543+0.3332X(r=0.9167)、Y=3.5878+0.2874X(r=0.9656)和Y=3.8188+0.2082X(r=0.9925),致死中浓度(LC50)分别为2.63×104、4.17×104和7.85×105孢子/mL,在1.0×108孢子/mL浓度下对西花蓟马成虫侵染致病的致死中时间(LT50)分别为5.67、4.91和6.12 d.[结论]黄绿绿僵菌菌株WSWL51721和球孢白僵菌菌株WSWL21836对西花蓟马成虫具有较强的毒力,可作为西花蓟马生防制剂开发的潜力菌株.     

广州地区一株绿僵菌的鉴定及其对草地贪夜蛾的致病力测定

[目的]寻找草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)致病性昆虫病原真菌,以丰富广东省本地的昆虫病原真菌资源库,为开展草地贪夜蛾微生物防治提供研究材料.[方法]对采自广东省广州市增城区荔城镇玉米地的感菌草地贪夜蛾幼虫体表病原真菌进行微生物常规分离纯化,采用形态学和ITS-rDNA序列分析相结合的方法对病原真菌进行鉴定,通过3种不同培养基(PDA、SMAY和添加草地贪夜蛾蛹壳PDA培养基)测定病原真菌菌落生长速率和产孢量,并采用浸虫法研究病原真菌对草地贪夜蛾2龄幼虫的致病力.[结果]从感菌草地贪夜蛾幼虫上分离获得病原真菌,编号GZSF-1,经鉴定为莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi).培养基类型对菌株GZSF-1菌丝生长和产孢存在显著影响(P<0.05),菌株在各培养基上的生长速率为0.76~2.10 mm/d,产孢量为0.33×106~21.67×106孢子/mL,其中在添加蛹壳PDA培养基上的生长速度最快且可获得最大产孢量.菌株GZSF-1接种草地贪夜蛾2龄幼虫后,随孢子悬浮液浓度的升高,幼虫的感病死亡率增加,当浓度达1×109孢子/mL时,幼虫的致死中时(LT50)为3.030 d,接菌7 d后幼虫的累计校正死亡率达100.00%.应用Probit模型,得到菌株GZSF-1对草地贪夜蛾2龄幼虫的致病力回归方程y=-4.426+0.737x,菌株GZSF-1对草地贪夜蛾2龄幼虫第7 d的致死中浓度(LC50)为1.02×106孢子/mL.[结论]从田间感菌草地贪夜蛾上分离获得的病原真菌菌株GZSF-1为莱氏绿僵菌,该菌株对草地贪夜蛾幼虫具有较好的生防潜力,具有进一步研究的价值.     

生防木霉SS003菌株(Trichoderma atroviride)的固体发酵工艺研究

为了探索酷绿木霉SS003菌株固体发酵产孢子的较优工艺条件.分别以酷绿木霉SS003菌株为供试菌和以玉米秸秆、麦麸发酵基质,分别进行了固体发酵培养基配方和固体发酵条件的优化筛选,试验设计均采用单因索试验.试验最终检测方法采用血球计数板倍量稀释法镜检孢子量(108个/g).分别获得了酷绿木霉SS003菌株产孢固体发酵的较优培养基配方和较优固体发酵条件,即80目的玉米秸秆与麦麸配比1:3,接种1×106个/mL的SS003孢子液,保持含水量55％和充分通气,培养11d后,酷绿木霉SS003菌株固体发酵产孢量达到最大(76.14×108个/g).初步探索到绿木霉SS003菌株固体发酵产孢的较优工艺条件,为该菌的深入研发提供了有益的试验数据.     

人工饲料对苹果蠹蛾颗粒体病毒产量的影响

优化增殖苹果蠹蛾颗粒体病毒张掖株(CypoGV-ZY)的饲料配方,为实现经济高效的病毒生产奠定技术基础。采用喂毒法,研究苹果蠹蛾人工饲料中苹果粉、酵母、小麦面粉、玉米粉4种主要营养成分不同配比对苹果蠹蛾幼虫生长及对CypoGV产量的影响。结果表明:添加酵母的饲料配方,幼虫体质量和病毒产量均显著提高;其中取食C配方饲料的染毒幼虫,病毒产量最高,单头死亡幼虫虫尸质量、单头幼虫产毒量及每克虫尸产毒量分别可达30.57mg、8.63×109和28.25×1010 g-1;用玉米粉取代该配方中的小麦面粉时,染毒幼虫的虫尸质量明显降低,病毒产量显著下降。可见,以酵母和小麦面粉作为主要营养成分的C配方饲料,能显著提高病毒的产量,最适于病毒增殖生产。     

蜡蚧轮枝菌固体培养条件研究

以大米为固体培养基质，测定了不同培养条件下对蜡蚧轮枝菌产孢的影响。研究结果表明，当培养温度为25℃、料水比为1：0．33、光照24h／d、添加1％的酵母浸粉时对产孢最为适宜，蜡蚧轮枝菌产孢量最高；而添加葡萄糖时，对该菌产孢有抑制作用。