假海源菌ZJCN121岩藻多糖酶的纯化及其性质

液态发酵培养假海源菌ZJCN121,粗酶液经过丙酮沉淀和Sephadex G-100柱层析分离纯化得到回收率为13.5%,纯化倍数为21.8,比活为20.59 IU·mg^-1的电泳纯岩藻多糖酶。采用SDS-PAGE电泳和EIF-PAGE电泳,分别测得酶的相对分子质量为60.2 kDa、等电点为4.3。该酶的最适反应温度为50℃,最适pH为6.5。其催化Fucus vesiculosus岩藻多糖的Km为5.87 mg·mL^-1,Vmax为6.11 g·L^-1·min^-1。Ca²⁺、Ba²⁺对酶稍有激活作用,Fe²⁺、Cu²⁺则强烈抑制酶活,Mn²⁺、K⁺、Zn²⁺也在一定程度上抑制酶活性,Mg²⁺对酶的作用效果不明显。     

南极磷虾体内胰蛋白酶的纯化及性质研究

以南极磷虾(Euphausia superb)为研究对象,通过硫酸铵分级沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析、DEAE-Sepharose FF离子交换层析等方法,从南极磷虾体内分离纯化出胰蛋白酶。其纯化倍数为5.44倍,比活力为38.3 U/mg,得率为26%。SDS-PAGE电泳结果显示,该酶的分子质量为28 ku。蛋白酶最适温度为37℃、最适pH为7.5,Mg2+、Ca2+、Mn2+对南极磷虾蛋白酶具有激活性,Zn2+、Cu2+、Fe3+具有酶活抑制性,其中Cu2+的抑制性最强。酶的动力学实验结果表明,以BApNA为底物测得Km为0.073 mmol/L,Vmax为1.44×10-2mmol/L·s,kcat为0.6S-1,kcat/Km为8.22×103,PMSF作为蛋白酶抑制剂,对南极磷虾蛋白酶作用机制为不可逆抑制。     

降解羽毛的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1角蛋白酶纯化及酶学性质研究

利用硫酸铵分级沉淀和交联葡聚糖G-100凝胶柱纯化了高效降解羽毛的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1所产角蛋白酶,纯化的角蛋白酶,经SDS-PAGE蛋白电泳分析,分子量为48.3 kda.结果表明,该酶最适反应温度和最适pH值分别为50℃和9.0,30～40℃具有较好的温度稳定性,60℃酶活下降很快;在pH7.0 ～9.5的范围内具有较好的稳定性.金属离子Ni2+、Zn2+对角蛋白酶具有明显抑制作用,Cu2+、Fe2、Fe3+能完全抑制酶活;1％巯基乙醇对酶具有明显激活作用.EDTA和PMSF对该角蛋白酶几乎完全抑制,可判定该酶是丝氨酸金属蛋白酶,是一种新的蛋白酶.     

Purification and Characterization of α-galactosidase from Rhizopus sp.A03

根霉(Rhizopus sp.A03)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了2.3倍,总酶活回收率达到25.9％,SDS-PAGE显示其相对分子质量为168.8 kDa.该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为45℃, 表观Km值为0.340±0.026 mmol/L,表观kcat/Km值为2.866×104 mol-l/(Ls);水解蜜二糖和棉子糖的表观速率均为10.0μmol/(h·mg);水解活性受Fe3+、Cu2+、Mn2+和Hg+等离子的强烈抑制,但Fe2+对酶活性具有显著的激活作用.该酶活性在pH4.0～8.9保持稳定,在45℃时保温60 min,残余酶活达到了77.4％.     

根霉A03α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质初步研究

根霉（Rhizopus sp.A03）发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了2.3倍,总酶活回收率达到25.9%,SDS-PAGE显示其相对分子质量为168.8 kDa。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为45℃,表观Km值为0.340±0.026 mmol/L,表观kcat/K_m值为2.866×10⁴ mol-1/（L·s）;水解蜜二糖和棉子糖的表观速率均为10.0μmol/（h·mg）;水解活性受Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺和Hg⁺等离子的强烈抑制,但Fe²⁺对酶活性具有显著的激活作用。该酶活性在pH4.0～8.9保持稳定,在45℃时保温60min,残余酶活达到了77.4%。     

普鲁兰短梗霉N2-3菌株碱性蛋白酶的纯化及性质研究

[目的]对普鲁兰短梗霉N2-3菌株的碱性蛋白酶进行纯化,并对其性质进行研究。[方法]利用层析柱Sephadex G-75与阴离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow纯化菌株N2-3的胞外碱性蛋白酶,并对纯化的酶进行SDS-PAGE凝胶电泳检测,同时对纯化蛋白酶的最适反应温度、温度稳定性、最适反应pH、pH稳定性进行测定,研究金属离子及各种化合物对蛋白酶活性的影响。[结果]试验中N2-3菌株的碱性蛋白酶纯化倍数和回收率分别为2.34和25.9%;SDS-PAGE凝胶电泳显示该酶的分子量约为33 kDa;该酶的最适反应温度和pH分别为52℃和9.0;Mn2+、Mg2+、Na+离子浓度在5 mmol/L时对纯化蛋白酶的酶活有激活作用,Zn2+、Ca2+、K+、Li+对酶活的影响不大,而当存在Fe2+、Fe3+、Cu2+、Co2+、Ag+、Hg2+离子时,蛋白酶活明显降低;苯甲基硫酰氟(PMSF)强烈抑制了该蛋白酶的活性,而乙二胺四乙酸(EDTA)与碘乙酸微弱抑制了该蛋白酶的活性。[结论]为普鲁兰短梗霉N2-3菌株碱性蛋白酶的工业化生产提供了一定的理论基础。     

香樟(Cinnamomum camphora)果实酪氨酸酶的分离纯化及特性分析

[目的]检测并分离香樟果实中的酪氨酸酶。[方法]从香樟成熟果实中分离和纯化出酪氨酸酶,研究该酶的酶活、蛋白质含量、最适pH值、最适温度、动力学特性和稳定性,并分析了不同金属离子、化合物和中药对其酶活的影响。[结果]经分离和纯化,获得43 kD的酪氨酸酶。该酶的最适pH值和最适温度分别为7.5和50℃。以L-DOPA为底物,测得Km和Vmax分别为12.83 mmol/L和180.65U/mg。该酶在pH值4~7和较高温度时均较为稳定。Al3+和Cu2+对该酶活性具有抑制作用,而Zn2+、Mg2+等则有激活作用。250mmol/LEDTA对该酶有激活作用,抗坏血酸和1 mmol/Lβ-巯基乙醇有完全抑制作用。中药女贞对其有强激活作用,乌梅对其抑制作用最明显。[结论]香樟果实中酪氨酸酶同工酶的存在为该酶的纯化带来一定难度。     

短小芽孢杆菌阿魏酸酯酶的分离纯化及性质研究

通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水层析,对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)发酵液中的阿魏酸酯酶进行分离纯化,并测定其部分酶学性质。结果表明,阿魏酸酯酶的纯化倍数为5.06,回收率达到14.8%。该酶的相对分子质量约为28.6 ku;最适反应温度为50℃,最适pH为5.8,在40~45℃和pH 5.8~8.2都能保持很高的稳定性。K~+、Co~(2+)、Ca~(2+)和DTT对酶活有明显的促进作用,而Cu~(2+)、乙醇和苯甲基磺酰氟严重抑制了其酶活。以阿魏酸甲酯为底物,测得Km为0.25 mmol/L,Vmax为6.27 U/(min·mg)。     

黑曲霉TH-2蔗糖酶的分离纯化及部分性质研究

实验室保存的菌种黑曲霉TH-2经柠檬酸-磷酸缓冲液抽提,DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,得到电泳纯的蔗糖酶.纯化后的蔗糖酶比活为135.90 U/mg,回收率为37.7%,提纯倍数为20.3倍.测得酶的相对分子质量为1.29×105,最适温度为65℃,最适pH值为4.4.以不同浓度蔗糖为底物测得Km值为23.1 mmol/L Ag+对其活性有很强的抑制作用,而Zn2+,Cu2+,Mn2+对其有激活作用.     

黑曲霉TH-2蔗糖酶的分离纯化及部分性质研究

实验室保存的菌种黑曲霉TH-2经柠檬酸-磷酸缓冲液抽提,DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,得到电泳纯的蔗糖酶.纯化后的蔗糖酶比活为135.90 U/mg,回收率为37.7%,提纯倍数为20.3倍.测得酶的相对分子质量为1.29×105,最适温度为65℃,最适pH值为4.4.以不同浓度蔗糖为底物测得Km值为23.1 mmol/L.Ag+对其活性有很强的抑制作用,而Zn2+,Cu2+,Mn2+对其有激活作用.     

重组酵母E22植酸酶的分离纯化及酶学性质研究

对用黑曲霉植酸酶基因构建的一株重组酵母E22所产植酸酶进行分离纯化并研究各种酶学性质,表明E22植酸酶分别在pH2.5～3.0和pH5.5左右具有2个最适pH峰,有活性pH范围为pH2.0～7.5,pH2.5时的最适温度为45℃左右、对植酸钠的Km值为0.000 2 mol/L、比活为493 328.7 u/mg、受Fe2+抑制,pH5.5时的最适温度为55℃.对植酸钠的Km值为0.000 1 mol/L、比活为624 376.2 u/mg、受Ca2+和Zn2+抑制,85℃热处理10 min酶活性保留70%,pH2.5下用胃蛋白酶、pH5.5下用胰蛋白酶处理6 h后酶活均保留90%左右,分子量为61.7KD,等电点在4.5到5.0之间.     

灰绿青霉阿魏酸酯酶的分离纯化和酶学性质研究

[目的]研究青霉(Penicillium glaucum)XGY36胞外产阿魏酸酯酶的纯化和酶学性质。[方法]菌株胞外产酶发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose DE52离子交换柱层析、Sephadex-G75分子筛层析进行纯化,得到纯度较高的酶蛋白,并对其酶学性质进行研究。[结果]从菌株发酵液中分离纯化到电泳纯的阿魏酸酯酶,纯化倍数6.54,酶活性回收59.7%。阿魏酸酯酶经SDS-PAGE获得1个条带,其表观分子量为36.5 ku。催化底物阿魏酸乙酯的最适反应温度为50℃,最适p H为5.0。阿魏酸酯酶在60℃以下和p H 3.0~7.0范围内稳定。金属离子Zn~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)对酶有明显的激活作用,而Pb~(2+)、Hg~(2+)和Ag+对阿魏酸酯酶有强烈的抑制作用,Na+、K+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Fe~(2+)对酶活的影响不大。[结论]青霉阿魏酸酯酶具有潜在的应用价值,适合应用于食品、医药及生物等领域。     

脂肪酶中具有壳聚糖降解活力酶组分的性质研究

[目的]为酶法降解壳聚糖提供科学依据。[方法]从脂肪酶中分离具壳聚糖降解活力的电泳纯酶,研究pH值、温度和金属离子对壳聚糖酶活力的影响,并分析了该酶的pH值稳定性、热稳定性和底物特异性。[结果]该酶降解壳聚糖的最适pH值为4.5,最适温度为60℃。Ni2+、Co2+和Mn2+对酶活具有明显的激活作用,而Fe3+、Pb2+和Hg2+则强烈抑制酶的活力。该酶对脱乙酰度为73%~82%的壳聚糖具有较高的水解活性,而对脱乙酰度为64%和90%的壳聚糖水解活力较低。[结论]该酶在pH值为5~9范围内和60℃以下都具有较好的稳定性。     

Paraconiothyrium variabile GHJ-4产漆酶发酵培养基优化及酶学性质研究

为了提高木质素降解子囊菌Paraconiothyrium variabile GHJ-4产漆酶的能力,采用响应面分析法优化其产酶培养基。最优的发酵培养基组成为:麸皮30 g·L~(-1),可溶性淀粉58.08 g·L~(-1),牛肉浸膏3.39 g·L~(-1),NaNO_3 1 g·L~(-1),KH_2PO_4 3 g·L~(-1),CuSO_4 0.554 g·L~(-1)。采用该优化培养基,GHJ-4菌株的漆酶酶活达到410.04 U·m L~(-1),比优化前提高9.5倍。以愈创木酚为底物,该菌株纯化漆酶的最适反应温度为50°C,最适反应pH为5.0,米氏常数Km为62.07μmol·L~(-1),最大反应速度Vmax为68.97 mmol·(L·min)-1;该漆酶在55°C以下、pH3.5~6.5的范围内较为稳定,Cu~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)对漆酶酶活有明显促进作用,而Hg~(2+)、Fe3+、Ag+对漆酶酶活有显著抑制作用。结果表明,Paraconiothyrium variabile GHJ-4是一株高效的漆酶产生菌株,具有潜在的工业化应用前景。     

DFRKN-1碱性磷酸酶的提取纯化和主要理化性质研究

[目的]提取纯化根结线虫天敌真菌-1(Destroying fungi of root-knot nematode-1,DFRKN-1)的碱性磷酸酶,并对其主要理化性质进行研究。[方法]以DFRKN-1为提酶材料,经正丁醇提取,硫酸铵分级沉淀分离,透析获得酶的粗提取液,用SephadexG-150凝胶过滤柱层析纯化,获得纯化碱性磷酸酶,并测定纯化碱性磷酸酶的理化性质。[结果]酶纯度达到电泳纯,提纯倍数达到15.7倍,比活力达5333 U/mg;该酶的最适pH值为8.9,最适温度为43℃,米氏常数为6.82 mmol/L;K+、Ba2+、Mg2+对该碱性磷酸酶的活性均有激活作用,甲醛、草酸、酒石酸对该碱性磷酸酶均有抑制作用。[结论]试验结果可为进一步深入研究DFRKN-1提供参考。     

一种新的镰刀菌Q7-31木聚糖酶Xyn9的分离纯化鉴定及酶学特性

为对植物病原菌镰刀菌(Fusarium sp.)Q7-31所产木聚糖酶进行鉴定及酶学特性分析,在发酵产酶培养基上对Q7-31进行发酵培养,获得能够高效降解植物细胞壁的粗酶液。然后,采用Sephacry S-100凝胶柱层析和DEAE弱阴离子交换柱层析对粗酶液进行分离纯化后得到木聚糖酶Xyn9,并对其开展蛋白质组学研究和酶学特性分析。结果表明:粗酶液中木聚糖酶比活为16.58 U/mg,纤维素酶比活为0.428 U/mg,细胞壁降解酶比活为0.019 8 U/mg,蛋白含量为2.17 mg/m L。Xyn9的蛋白质组学研究结果显示,其分子量为21 ku、等电点为6.86,接近GH10家族。纯化后Xyn9的酶学特性表明,最适反应温度为47℃,最适p H值为5.6,该酶在33℃以下和在p H值5~6的范围内较稳定;金属离子K+对该酶有激活作用,Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+抑制该酶活性,Cu2+、Hg+使该酶完全失活。综合Xyn9的分子量、蛋白质组学结果以及酶学特性,最终将其鉴定为一种新的介于GH10家族与GH11家族之间的内切木聚糖酶。     

产碱假单胞菌精氨酸脱亚胺酶的纯化

提取精氨酸脱亚胺酶粗酶液,采用硫酸铵分级沉淀法初步分离精氨酸脱亚胺酶,然后通过DEAESephadex A 50柱色谱层析和Sephadex G-100柱色谱层析进一步分离纯化精氨酸脱亚胺酶,并利用SDS-PAGE电泳法来鉴定其纯度,最终达到纯化产碱假单胞菌来源的精氨酸脱亚胺酶(ADI)的目的。结果表明:分离纯化过程中,粗酶液的总酶活为424.43 U,比酶活为0.42 U·mg~(-1);盐析透析酶液的总酶活是222.10 U,比酶活为2.05 U·mg~(-1);离子交换分析活性部位的总酶活为105.83 U,比酶活是5.61 U·mg~(-1);凝胶渗透分析活性部位的总酶活为17.94 U,比酶活为11.80 U·mg~(-1)。纯化得到了电泳纯级别的ADI,其相对纯度为96%。因此,本研究方法可以得到较高纯度和酶活的精氨酸脱亚胺酶。     

鸡心SOD的分离纯化及部分性质研究

为从新鲜鸡心中获得锰超氧化物歧化酶的电泳纯制品并进行性质研究,将鸡机心匀浆,抽提,正丁醇除脂,丙酮分级沉淀,DEAE-Sepharose层析和Superdex-200层析结果为:酶的比活是1 633U/mg,纯化倍数是139.16,全分子相对分子质量是1.037×105,亚基相对分子质量2.63×104.该酶在50℃～70℃有较好的稳定性,最适温度是40℃,pH值在3～9之间有较好的稳定性.Ca2+、二硫苏糖醇、尿素对鸡心SOD有一定的激活作用,Ba2+和Zn2+对鸡心SOD抑制作用较弱,Cu2+抑制作用较强,低摩尔浓度乙二胺四乙酸二钠对酶有激活作用,高摩尔浓度有抑制作用.     

沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶在大肠杆菌中的表达、纯化及其生化鉴定

为深入了解沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶的生化特性及功能,将该酶基因克隆到表达载体中,转入大肠杆菌中诱导表达,表达产物经monomeric avidin-Sepharose亲和层析分离纯化,获得了纯的沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶.结果表明:纯化后的草酰乙酸脱羧酶经SDS-PAGE检测,呈现3条蛋白谱带,相对分子质量分别为65×103、46×103、8.8×103左右;该酶不耐高温,50 ℃温浴1 h后活力几乎完全丧失;其最适pH为6.0左右;1 mmol·L-1Zn2+、0.5 mmol·L-1草酸和20 mmol·L-1丙酮酸几乎完全抑制该酶的活力,10～20 mmol·L-1NaCl对该酶有明显激活作用,但200～500 mmol·L-1的NaCl对该酶却有明显抑制作用.     

米胚芽谷氨酸脱羧酶的分离纯化及部分酶学性质的研究

【目的】分离纯化米胚芽谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD),并对其酶学性质进行研究。【方法】通过(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE-Sephrose FF离子交换色谱、Superdex 200凝胶过滤色谱和Glu SephroseCL 4B亲和色谱等分离纯化技术,对米胚芽GAD进行分离纯化。用体积排阻高效液相色谱测定米胚GAD的相对分子质量,SDS-PAGE测定其亚基的相对分子质量。测定米胚GAD的最适温度和pH,通过酶动力学试验测定其动力学常数(Km)和最大反应速度(Vmax),并测定KCl和MgSO4等化学物质对酶活性的影响。【结果】分离纯化得到了米胚GAD,其纯化倍数为65.7,比活达223.4 U/mg,酶活回收率为10.8%。米胚GAD的相对分子质量为78 ku,亚基相对分子质量为40 ku,说明米胚GAD是由2个相同亚基构成的二聚体。米胚GAD的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.6;米胚GAD的热稳定较差,80℃时酶几乎完全失活;米胚GAD在pH 4.5~8.0较为稳定,能保持88%以上的酶活。米胚GAD对谷氨酸Glu的Km为32.3 mmol/L,Vmax为1.159 mg/min;对磷酸吡哆醛(PLP)的Km为1.7μmol/L,Vmax为1.171 mg/min。K+和Ag2+对米胚GAD的活力有较大抑制,Mg2+、Mn2+、Al3+和Li2+等对活性影响不大,500μmol/L Ca2+对米胚GAD有较强的激活作用。【结论】米胚GAD的性质与其他植物GAD存在差异。