外源添加乙偶姻对酿酒酵母产2,3-丁二醇及其菌株的影响

通过对菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株.本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5/W5-△pdc1/W5-△pdc5/W141四株菌株为试材,利用高效液相色谱法(HPLC)对乙偶姻产量和BDH酶活进行检测,从而挑选出最适合作为产2,3-BD...     

从合成生态学角度提高酿酒酵母产2,3-丁二醇的研究进展

2,3-丁二醇(2,3-Butanediol,2,3-BD)在化工、医药以及航天等多领域用途广泛,其被称为重要的平台化合物。为了解决2,3-BD需求量巨大且石油紧缺的问题,在分析酿酒酵母生产2,3-BD优势的基础上,探讨了自上而下和自下而上的两种工程微生物群体构建策略,以期利用酿酒酵母和伴生菌株共培养生产2,3-BD。同时本文也从合成生态学角度出发,归纳了合成生态学在恢复生态、医疗以及生产实践方面的应用,并提出利用合成生态学理论促使酿酒酵母生产2,3-BD的可行性。     

外源添加乙酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)产2,3-丁二醇影响初探

为验证乙酸作为信号分子的作用,本研究分别将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W141上清液(对照组)、W141-07 (△aldh6)上清液及1.5 g/L乙酸添加至对数生长期的W141发酵液中,检测2,3-BD产量、乙酰乳酸合成酶(ILV2)及2,3-丁二醇脱氢酶(BDH1)酶活。结果表明:当添加1.5 g/L乙酸时,2,3-BD产量、ILV2和BDH1酶活性均达到最高,分别为3.01±0.04 g/L、1.41±0.03 U/mg和0.12±0.002 U/mg,且较其余两组相比差异极显著(P<0.01)。同时,测定3组条件下ilv2(24 h)和bdh1(60 h)基因的表达情况时发现,添加W141-07上清液后,ilv2和bdh1基因的表达量分别下调了31.6%和25.0%;而添加1.5 g/L乙酸后,ilv2和bdh1的表达量均发生上调,分别是对照组的4.38及1.24倍。表明乙酸可作为信号分子驱动相关基因的表达,进而提高2,3-BD产量。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3菌株发酵特性研究

通过对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3进行菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。本研究采用摇瓶发酵法,改变发酵过程中的底物浓度、溶氧量和酸碱浓度,紫外分光光度法和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测2,3-BD合成途径中关键中间产物(丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻)含量和发酵产物浓度。结果表明:S. cerevisiae WBG3菌株生长良好,在80 g/L葡萄糖、30℃和200 r/min条件下,丙酮酸、α-乙酰乳酸和乙偶姻含量分别达到0.10±0.03 g/L、3.38±0.06 g/L和0.17±0.02 g/L,乙醇转化率最低为0.44±0.02 g/g。添加乙酸后,甘油产量和乙醇转化率分别较对照组降低了9.5%和10%,2,3-BD的最终产量为0.36±0.02 g/L。因此,S. cerevisiae WBG3具备生产2,3-BD的潜力。     

外源添加乙偶姻对酿酒酵母W5/W141产2,3-丁二醇的影响

本研究旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。向酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W5/W141两株产2,3-BD菌株中添加不同浓度乙偶姻,并测定2,3-BD、乙醇和甘油产量随发酵时间的变化情况。S. cerevisiae W5最适乙偶姻添加浓度为12 g/L,且2,3-BD的产量在72 h达到最大,产量为2.54±0.03 g/L,甘油和乙醇转化率分别较未添加时下降了17.6%和23.6%。S. cerevisiae W141最适乙偶姻添加浓度为10 g/L,且2,3-BD的产量在72 h达到最大,产量为1.71±0.02 g/L,甘油和乙醇转化率分别较未添加时下降了57.1%和16.7%。通过对比,本课题最终选用S. cerevisiae W5作为最适菌株,为微生物发酵法生产2,3-BD提供新的资源。     

CRISPR/Cas9技术敲除酿酒酵母gpd2基因对产2,3-丁二醇的影响

旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除酿酒酵母甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2),探究其对2,3-丁二醇产量的影响。根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2)设计供体片段及gRNA片段,将gRNA片段与可表达Cas9蛋白的敲除载体相连,之后将重组质粒及供体DNA片段转化到S. cerevisiae W5细胞中,根据表型筛选及PCR验证获得gpd2基因缺失菌株。结果表明目的基因gpd2敲除成功,基因缺失菌株与原始菌株经发酵实验相比,甘油产量下降22.01%,乙醇产量提高24.65%,2,3-丁二醇产量下降10.60%。gpd2基因的敲除并没有提高2,3-丁二醇的产量,原因可能是逐渐积累的NADH会优先被细胞内大量的乙醇脱氢酶所氧化,作用于乙醇的产生,而不是优先作用于2,3-丁二醇的合成。本实验构建了适用于酿酒酵母的基因敲除系统,该系统对进一步探究酿酒酵母其他代谢产物与2,3-丁二醇合成之间的关系具有实际的借鉴意义。     

纳豆激酶高产菌株的筛选鉴定及特性研究

从5种不同样品中分离得到30株菌株,通过初筛和复筛,筛选出1株纳豆激酶高产菌株T-3,其产酶活性可达到3158.97IU/mL,并对菌株的个体形态、菌落形态和生理生化特征进行了鉴定,确认菌株T-3属于枯草芽孢杆菌属。该菌株对温度、pH值和胆盐具有较好的耐受性,并且具有良好的传代稳定性。     

刺葡萄酿酒酵母菌株的分离与筛选

为寻找适合酿造刺葡萄果酒的酵母菌株,从刺葡萄原酒、新鲜刺葡萄以及经初发酵过滤所得的刺葡萄皮渣中分离提取得到90株酿酒酵母,并对经发酵试验初步筛选出的5株酵母进行了耐酒精、耐糖、耐酸和耐二氧化硫的性能测定比较,最终筛选出1株发酵性能优良的菌株(B54)。该菌株具有很高的耐酒精能力,在18%的酒精浓度条件下也能迅速启动发酵,同时在高浓度SO2(250 mg/L)条件下发酵启动最快,并能耐受2.0%浓度的柠檬酸,较其他菌株具有更强的耐酸性,因此可作为刺葡萄酿酒的专用菌株。     

栓菌属高产漆酶菌株的筛选及其发酵产酶条件研究初报

从秦岭采集的15株栓菌属真菌中筛选出产漆酶能力最强的菌株03588,对其发酵产酶条件的研究结果表明其产酶最适碳源为葡萄糖,最适氮源为硝酸铵。起始最适pH为6.0,最适培养温度为28℃,5d酶活达到最大值。培养基装量对产酶的影响不大。     

高产淀粉酶菌株的分离及发酵工艺改良

从自然界中筛选高产淀粉酶菌株,为工业生产淀粉酶提供储备菌株。利用淀粉水解圈直径与菌落的直径比和单糖含量为指标,筛选出高产淀粉酶的菌株,运用均匀试验设计,结合DPS数据处理软件分析,从温度和pH值两方面改良并优化发酵条件,提高菌株产酶能力。结果表明,经筛选后得到的产淀粉酶菌株为米曲霉QA96.8(Aspergillus oryzae),最佳发酵条件为:温度40℃,培养基pH值4.0。由其发酵所得的淀粉酶最适反应温度为55℃,最适作用pH值5.0,同时测得酶活力为3900U/mL。     

单倍体酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因(pdc1)的敲除与鉴定

为了抑制单倍体酿酒酵母H14的副产物乙醇的合成,使得2,3-丁二醇产量的提升。利用基因工程手段构建载体pWCL-pdc1,获得两端含40 bp pdc1的同源重组片段-loxP-kanMX-loxP。利用Cre/loxP技术获得pdc1缺失菌株S. cerevisiae H14-01 (△pdc1)。并以野生型菌株S. cerevisiae H14为对照,进行摇瓶发酵试验。S. cerevisiae H14-01长势明显略低于原始菌株。在整个发酵期间,2,3-丁二醇的最高产量和转化率分别为0.373±0.016 g/L和0.005 g/g,分别较原始菌株提高了37.30%和4.66%,但原始菌株没有检测到乙偶姻和2,3-BD生成。另外S. cerevisiae H14-01的乙醇转化率降低了33.24%,但甘油产量提高了15.76%。说明了碳流流向乙醇被阻断之后,会增加2,3-丁二醇的产量,同时会使此部分碳流流向甘油。因此,并为进一步获得高产2,3-丁二醇的工程微生物群体奠定了基础。     

添加汉麻籽多肽对啤酒酵母生长的影响研究

以酵母活菌数、菌干重、酵母菌形态和生长曲线为指标,通过在YEPD培养基和麦芽汁培养基中添加汉麻籽多肽,研究了添加汉麻籽多肽对啤酒酵母生长的影响。以精酿啤酒发酵结束时啤酒酵母的活菌数为指标,通过正交试验研究了主发酵温度、汉麻籽多肽添加量和添加时期对精酿啤酒中啤酒酵母生长的影响。结果发现,添加汉麻籽多肽可以提高YEPD培养基中啤酒酵母的活菌数和菌干重,以0.5%汉麻籽多肽的添加量为最佳;添加汉麻籽多肽对啤酒酵母生长曲线的趋势影响不大,但可以显著提高指数期到稳定期啤酒酵母的数量;影响啤酒酵母在精酿啤酒中活菌数量的各因素主次关系为主发酵温度>汉麻籽多肽添加量>汉麻籽多肽添加时期,提高精酿啤酒活菌数量的最佳条件为主发酵温度8℃,汉麻籽多肽添加量0.5%,在主发酵后添加。     

产菊糖酶菌株的选育及特性研究

从发霉的菊芋中分离得到菌种,用平板透明圈法筛选出2株产菊糖酶活力较高的菌株H10和Q12。经菌种形态学观察和鉴定,确定菌株H10为黑曲霉,Q12为青霉,并对其进行了发酵条件的研究。两菌株产酶的环境条件有一定差异,黑曲霉以基质含2%菊糖,初始pH值7.0,装量50mL(250mL的三角瓶中),温度28℃,转速240r/min为摇瓶发酵最适条件;青霉以基质含3%菊糖,初始pH值6.0,装量50mL(250mL的三角瓶中),温度30℃,转速240r/min为摇瓶发酵最适条件。黑曲霉和青霉产酶分别在120h和96h时达到高峰。     

脂肪酶及其产生菌的筛选与改良研究进展

脂肪酶(lipase,E.C.3.1.1.3,甘油酯水解酶)是一类特殊的酯键水解酶,能在异相系统(油—水)界面上水解特殊酯(脂肪酸甘油酯)类,具有重要而广泛的工业用途。综述了脂肪酶及其产生菌的筛选与改良研究进展。     

工业酿酒酵母PGK启动子的克隆与功能分析

为了获得适用于构建工业酿酒酵母整合型表达载体的组成型启动子,以工业酿酒酵母南阳K基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到了磷酸甘油酸激酶基因起始密码前的启动子片段2个,其中长片段781 bp,命名为PGK1（GenBank Acession No. FJ415226）。NCBI Blast软件分析结果表明,PGK1核苷酸序列与酿酒酵母染色体Ⅲ上PGK启动子（GenBank Acession No. X59720）相似性为99%,序列中含有基因表达所需的基本调控元件TATA-box和CAAT-box等。功能分析表明PGK1能驱动整合在工业酿酒酵母基因组上的外源基因葡萄糖淀粉酶基因的表达。综上表明成功克隆得到PGK1启动子,为工业酿酒酵母表达载体的构建奠定了基础。