水牛胚胎体外生产研究综述

近年来采用其它家畜上的程序来进行水牛体外胚胎生产（in vitro production,IVP）引起了越来越多的关注。水牛胚胎体外生产已获得了较高的卵母细胞成熟率、受精率和卵裂率,但囊胚发育率和体外胚的移植成功率仍较低,水牛IVP胚胎体外生产效率比黄牛低得多。在IVP技术应用于水牛生产育种之前,还有一些问题必须解决。本文对水牛胚胎体外生产的不同技术,包括未成熟卵母细胞的体外培养成熟和受精以及胚胎体外培养卵裂发育至囊胚等进行综述。文章还讨论了胚胎体外生产存在的问题及可能的解决方案。     

不同冻精处理方法和添加咖啡因对牛体外受精的影响

【目的】为了探讨不同冻精处理方法以及添加精子活力激活剂并孵育不同时间获能对体外受精及受精卵发育的影响。【方法】研究对体外受精前的牛冷冻精液分别采用直接离心法、上游法和Percoll法3种方法处理,并对处理后的精液分别用含2.5mM或5.0mM咖啡因的获能液（BO液＋10μg/ml肝素钠）在培养箱内预先孵育10min或30min进行获能,不同处理的精子经体外受精后。【结果】结果表明：（1）3种冻精处理方法（直接离心洗涤法、上游法、Percoll法）对精子处理获能,IVF后受精卵的卵裂率（依次为51.58%、52.83%、53.20%）均无显著差异（P＞0.05）;桑椹胚、囊胚发育率Percoll法处理组（16.66%、10.18%）与上游法处理组（17.85%、16.07%）以及Percoll法处理组与直接离心洗涤法组（8.77%、7.01%）均无统计学差异（P＞0.05）,同时实验结果还表现出上游法处理组比Percoll处理组的桑囊胚率有所提高,且上游法处理组与洗涤法处理组在桑、囊率上出现了显著差异（P＜0.05）。（2）获能液中添加咖啡因组比非添加组(对照组)卵裂率和桑囊胚率有所增加,其中添加5.0mM咖啡因组精子孵育30min的获能效果最佳,卵裂率、桑囊率达到68.59%、28.50%。【结论】以上结果表明上游法处理牛冷冻精液稍优,更有利于以后的受精卵发育;添加咖啡因能提高精子活力,且高浓度的咖啡因维持精子高活力持续时间较长。     

体外成熟培养时间对牛卵母细胞孤雌发育的影响

为了探讨牛卵母细胞体外成熟培养时间对孤雌胚胎发育的影响,通过比较18.5、22和25.5 h等3个不同成熟培养时间下孤雌胚的卵裂率和囊胚率,从而确定较为理想的体外成熟培养时间。试验结果发现,体外不同成熟培养时间下卵母细胞的孤雌卵裂率之间并无显著差异,虽然体外培养22 h卵母细胞的孤雌卵裂率稍稍高于体外培养18.5 h和25.5 h卵母细胞的孤雌胚卵裂率,但差异不显著;而不同成熟培养时间下卵母细胞的孤雌囊胚率之间存在着显著的差异,体外成熟培养22 h卵母细胞的孤雌囊胚率显著高于其它两组。该结果证明卵母细胞体外培养时间是影响孤雌胚发育的一个重要因素,体外培养时间过长或过短都会对孤雌胚今后的发育产生不利影响。     

血管内皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响研究

为了探讨适宜浓度的(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)对猪卵母细胞体外成熟的影响,以提高猪卵母细胞的成熟效果进而促进胚胎的后期发育,以期为进一步改善猪卵母细胞体外成熟体系提供参考。本研究通过在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的VEGF,成熟培养液(TCM199+BSA)中分别添加0 ng/mL VEGF对照组、5 ng/mL VEGF试验组Ⅰ、50 ng/mL VEGF试验组Ⅱ、500 ng/mL VEGF试验组Ⅲ的卵母细胞成熟培养后,经孤雌或体外受精和体外培养。结果表明：（1）试验组Ⅰ极显著地提高了猪卵母细胞的成熟率,试验组Ⅱ显著提高了猪卵母细胞的成熟率;（2）成熟的卵母细胞经孤雌激活和体外培养后,试验组Ⅰ极显著提高了孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。试验组Ⅱ显著提高了孤雌胚胎的卵裂率、极显著的提高了囊胚率;（3）成熟的猪卵母细胞经体外受精和体外培养后,试验组Ⅰ显著地提高了体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率,试验组Ⅱ显著地提高了体外受精的卵裂率、极显著地提高了囊胚率。5 ng/mL或50 ng/mL的VEGF,有利于促进猪卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育。     

不同因素对牛IVF胚胎体外发育影响的研究

为进一步完善牛胚胎体外发育体系,以体外受精胚胎为研究对象,对精子获能液、胚胎培养液、血清与BSA添加浓度、卵丘细胞共培养等影响体外胚胎发育体系的各个因素进行筛选优化。结果表明,BO获能液比普通获能液能够获得更高的卵裂率;添加葡萄糖、BSA以及不同浓度血清的牛胚胎培养液比未添加组有更好的发育效果,卵裂率、囊胚率分别达到(79.85±0.74)%、(28.69±1.45)%;在此基础上,牛卵丘细胞与牛胚胎共培养可将囊胚率进一步提高至(32.70±1.73)%,并用免疫荧光染色验证其卵丘细胞未发生凋亡。本研究进一步优化了牛胚胎体外发育体系,提高了体外胚胎的囊胚发育率。     

PGE2可以恢复缺少内源性PGs的牛体外早期胚胎的正常发育

旨在研究外源添加PGE2(前列腺素E2)对缺少内源性前列腺素(PGs,Prostaglandins)的牛IVF早期胚胎外发育的影响。在牛IVF胚胎中抑制内源前列腺素合成再外源添加PGE2,以观察PGE2对牛IVF胚胎发育的作用以及起作用的胚胎阶段。并检测PGE2受体的mRNA水平。抑制胚胎内源性前列腺素合成限速酶COX-1和COX-2会使牛IVF胚胎卵裂率、8-16细胞率、囊胚率以及孵化率显著低于常规培养组;而外源添加PGE2能够补偿IVF胚胎因缺少内源性PGs导致的损伤,基本抵消COX-1和COX-2的特异性抑制剂对牛早期胚胎体外发育产生的不利影响;PGE2的添加浓度以1×10-8mol/L为宜,并且其补偿作用发生在8细胞阶段之前。利用半定量RT-PCR未能检测到以上6个阶段IVF胚胎上EP1、EP2、EP3和EP4四种受体的mRNA。PGE2可以恢复缺少内源性PG的牛体外IVF早期胚胎的正常发育。     

牛体细胞核移植技术体系的优化

为了提升卵母细胞成熟质量和核移植胚胎的体外发育潜能,在卵母细胞成熟液和胚胎培养液中分别添加不同浓度IGF及胎牛血清FBS,并探讨了二者对牛卵母细胞成熟培养、核移植胚胎发育的影响以及相关性能的变化。结果表明:分别在成熟液中添加40 ng/mL IGF、培养液中添加20%FBS后,成熟率、卵裂率、囊胚率均有显著提高。本研究为今后牛体细胞核移植技术体系的优化和完善打下了坚实的理论基础。     

组织蛋白酶抑制剂E-64对猪卵母细胞体外发育能力的影响

为探明外源性组织蛋白酶抑制剂(E-64)对猪卵母细胞体外发育能力的影响,通过向成熟液中添加1、5、10μmol/L的外源性组织蛋白酶抑制剂,对猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)进行体外成熟培养46 h,统计第一极体率,随后分别进行体外受精和孤雌激活,统计第2天的卵裂率和第7天的囊胚率。结果表明,成熟液中加入1μmol/L E-64的第一极体排出率显著高于未添加的对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组。将体外成熟的卵母细胞进行体外受精及孤雌激活,体外受精后胚胎的卵裂率与囊胚率结果均为成熟液中加入1μmol/L E-64的添加组显著高于对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组;孤雌激活后,4组间胚胎的卵裂率差异不显著,囊胚率为10μmol/L E-64的添加组显著低于其他3组。因此1μmol/L E-64能促进猪卵母细胞的核成熟,并能进一步提高其体外受精后的卵裂率和体外培养的囊胚率。     

卵泡液对牛卵母细胞发育潜力的影响

为了确定卵泡液(直径大于10 mm)对卵母细胞成熟的影响,共收集1759枚卵母细胞进行试验。在成熟液中分别添加0%,10%,30%和50%的卵泡液(bFF, bovine follicular fluid ),成熟培养24h后,孤雌激活或者体外受精和胚胎培养;对比10% bFF和10% 胎牛血清（FBS）,以及观察微滴培养对卵母细胞成熟的影响。结果表明,在孤雌激活组中,bFF浓度对卵裂率的影响差异不显著,但胚胎囊胚发育率高于对照组（P<0.05）;在体外受精组中随着bFF浓度增加而卵裂率下降(P<0.01),而且囊胚率也下降(P<0.05)。在10%的bFF组中,孤雌激活囊胚率和体外受精囊胚率分别为47.1% 和38.0%,囊胚扩张率显著高于其它组。从试验得出,添加10% bFF有利于卵母细胞胞质成熟,且不会降低到受精率,而且可以替代FBS;微滴培养不利于卵母细胞成熟。     

奶牛性控胚胎体外生产的影响因素及控制措施

针对奶牛胚胎体外生产环节,对体外受精和培养等技术进行了研究,旨在建立奶牛性控胚胎体外生产技术体系。结果表明,卵母细胞外周卵丘细胞至少保持3层以上,在成熟基础液中添加10 ng/ml的EGF,利于核质成熟;在精子获能液中添加咖啡因降低精子的存活时间;牛胚胎前3 d用CR1aa+BSA培养,再用SOFaa+5%FBS培养,获得高的囊胚发育率,并且添加50 ng/ml IGF-I后胚胎的发育得到了很大的改善。利用性控精液进行体外受精,受精率有轻微下降,但对生产的胚胎发育质量无明显（P>0.05）影响,胚胎移植后受胎率为40%左右。     

大丽花花粉活力及离体萌发研究

为筛选大丽花花粉活力有效的测定方法,了解大丽花不同品种的花粉活力,以大丽花栽培品种为试验材料,采用4种方法检测大丽花花粉活力,在此基础上,采用单因素试验和正交设计试验分别对大丽花花粉的离体萌发培养条件及培养基组分进行优化,得到最优方案后进一步检测、比较不同品种之间的花粉活力。研究结果显示,TTC染色法不能使花粉着色,I₂-KI和孢粉染色法不能有效区分有活力和无活力花粉,离体萌发法效果良好,可准确直观地反映大丽花花粉活力状况, 是测定大丽花花粉活力的有效方法。当培养条件为pH 6.0、温度25℃、培养时间2.5 h时,花粉萌发率最高。培养基组分对大丽花花粉萌发的影响程度依次为PEG>蔗糖>硼酸,实际最佳处理组合为A₃B₄C₂,即PEG4000 25 g/L、蔗糖60 g/L、硼酸50 mg/L的处理组合下,大丽花花粉萌发率最高达62.1%。采用上述获得的最优方案检测22个大丽花品种的花粉活力,花粉萌发率为11.75%~78.72%,不同品种的花粉萌发率差异大,其中,‘兰花公主’的花粉萌发率最低,‘波彻儿’最高。大丽花品种的花粉活力多样性丰富,所测定的22个大丽花品种有14个品种正常可育,杂交时可用作父本;8个品种为半不育或低不育,杂交时更适合作母本。     

不同夜间温度处理对马铃薯试管薯及块茎形成相关基因表达的影响

为探究不同夜间温度处理对马铃薯试管薯形成的影响,以7个马铃薯品种或材料的试管苗为试材,在昼/夜温度分别为23℃/13℃、23℃/18℃和23℃/23℃条件下进行试管薯的诱导培养,调查记录试管薯初始结薯时间、结薯率和结薯方式变化,并分析不同夜间温度处理下试管薯初始形成植株及同期未形成试管薯植株参与块茎形成相关基因的表达量变化。结果表明,对于大多数基因型,与其他处理相比,23℃/13℃处理显著延长试管薯初始结薯时间,23℃/23℃处理降低结薯率,而23℃/18℃处理结薯较早且试管薯结薯率平均达84.3%,最利于试管薯形成。夜间温度可通过影响生物钟、糖代谢和光周期通路中StFKF1、StCO1和StSWEET1等相关基因的表达而调控块茎形成。     

光温处理对甘蔗试管苗光合自养生根的影响

为了提高甘蔗试管苗光合自养生根的成功率,设置了不同季节光温、光补偿和不同光质处理,通过调查无根试管苗生根率、存活率、苗高、根长和单株根数,分析这些因素对无根试管苗生根和生长的影响。结果表明,冬季低温弱光照时期甘蔗试管苗光合自养生根的生根率和存活率比夏季高温强光照时降低。冬季光补偿可以促进无根试管苗植株生长和根系伸长,但对试管苗的生根率和存活率没有显著影响。与自然光处理相比,单独红光和蓝光处理不利于甘蔗试管苗的生根与生长,而自然光补充蓝光或红光均能促进试管苗增高及根伸长,对试管苗的生根率和存活率没有显著影响。     

国内外8个不同种源地莲(Nelumbo)的成熟胚离体培养比较

建立高效获取无菌莲胚外植体的消毒体系,了解不同种源地莲的离体培养生长差异,为今后构建莲的优良离体培养及遗传转化体系提供可靠的材料和评估方法。使用不同浓度植物保护混合剂(plant preservative mixture,PPM)预培养法确定适宜的莲子消毒体系和无菌莲胚获取方式;在此基础上获得国内外9个种源地莲的成熟胚离体培养幼苗,通过观测其在不同培养时期的形态指标,利用隶属函数法综合评价其离体条件下的生长差异。研究发现,莲子比较理想的消毒体系为75%酒精消毒30 s + 2% PPM消毒2 h + 0.05% PPM浸泡催芽3~5天。其中,8个参试种源地莲的离体生长差异主要体现在培养后期,表现在展开叶数、茎节长度和粗度、根数及侧芽数等指标上。在相同培养条件下,越南莲和泰国莲的生长势最好、繁殖率较高。使用PPM浸泡成熟莲子进行预培养以获取无菌莲胚的方式,克服了以往莲子消毒不理想的技术难题。热带、亚热带分布的越南莲和泰国莲的离体无性系生长势强,是构建莲再生体系和遗传转化体系的良好原材料。     

花粉活力不同测定方法的比较和离体培养初探——黄山玉兰

为了比较不同花粉活力测定方法的应用效果,本研究利用黄山玉兰(Yulania cylindrica)花粉作为实验材料,采用MTT染色法、TTC染色法、醋酸洋红染色法分别测定黄山玉兰自然盛开、室内水培盛开、室内培养萎蔫时的花粉活力;同时采用不同浓度梯度的硼酸、蔗糖溶液进行花粉离体培养。结果表明：醋酸洋红染色法测得的活力偏高,均值为96.94%;TTC染色法所测活力偏低,为39.52%;MTT染色法所测活力最为合适,均值为85.46%;而花粉离体培养最佳的溶液浓度是5%的蔗糖溶液和0.01%的硼酸溶液。黄山玉兰花粉活力的不同测定方法比较和花粉离体培养为其他物种繁育相关研究提供了借鉴。