小西葫芦黄花叶病毒dsRNA的原核表达及其对ZYMV的防治效果

【目的】小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)是危害西瓜最为普遍的病毒,在西瓜上利用外源喷施病毒基因dsRNA的方法实现对ZYMV的预防和治疗。【方法】首先以实验室已有的ZYMV病毒序列为依据,针对其不同的基因片段,利用NCBI数据库找出与其相似的序列。随后利用软件DNAMAN8对序列进行多重比对分析,找出其保守区域,根据分析结果选择长度介于200—350 bp的ZYMV 3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段,同时选择长度为190 bp的GUS基因片段作为对照。PCR扩增得到这6个片段后,利用同源重组的方法将它们插入到含有双T7启动子的L4440载体中,并利用RNAⅢ酶缺陷型大肠杆菌HT115建立原核表达系统生产dsRNA,采用超声波破碎的方法释放dsRNA,利用TE(10 mmol·L^-1 Tris-HCl和1 mmol·L^-1 EDTA)缓冲液溶解dsRNA,最后比较和分析IPTG使用浓度、诱导时间以及超声波破碎时间对dsRNA表达和释放的影响。在西瓜植株上采用喷施...     

小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的RT-PCR检测

小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）是葫芦科作物上的一种重要病毒,近几年来已成了我国葫芦科作物上的一种重要病原物。根据已知的ZYMV基因组序列分别设计了2对特异性引物,在优化RT—PCR条件的基础上,成功建立了ZYMV的RT—PCR检测方法。引物ZYM1／ZYM2用于扩增整个CP基因序列（片段长度949bp）,而引物ZYM3／ZYM4用于扩增部分CP基因序列（片段长度449bp）,其中,引物ZYM3／ZYM4的检测灵敏度比引物ZYM1／ZYM2的检测灵敏度高。把所建立的方法用于南瓜（Cucurbita moschata）、丝瓜（如如cylindrica）病叶的检测,结果在这些病叶中也检出ZYMV。因此,该方法可用于ZYMV的快速、灵敏检测及分子流行病学的调查研究。     

小西葫芦黄花叶病毒研究进展

小西葫芦黄花叶病毒病是瓜类作物的一种严重病害。本文对小西葫芦黄花叶病毒的分类、结构特点、生物学特性及其病毒载体的研究现状进行综述,以期为其防治提供参考。     

小西葫芦黄花叶病毒研究进展

小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus),同时也是一种侵染葫芦科植物的主要病毒,近年来该病毒的危害愈加严重,如何防控ZYMV已经成为种植户和社会高度关注的问题。本研究就ZYMV的分类地位、传播途径、检测方法、防治方法等进行综述,并进行展望。     

小西葫芦花叶病毒(ZYMV)抗血清制备及检测技术研究

从小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)免疫的母鸡蛋卵黄和兔抗血清中分别提取免疫球蛋白IgY和IgG,用多种血清学方法进行检测。结果表明,免疫鸡和兔25d后,鸡蛋卵黄IgY和兔抗血清的效价分别达到1/64和1/512。在琼脂扩散试验中,当抗体稀释28倍时,与抗原反应无明显沉淀线。在胶乳凝集试验中,抗体稀释210倍时,与抗原反应无明显凝集物。ELISA法以辣根过氧化酶标记抗体IgY和IgG,用双抗夹心法成功地检测出了ZYMV,当抗体稀释106倍时,与抗原反应仍呈阳性。免疫电镜方法检测ZYMV,较一般血清学方法可多捕捉50倍的病毒颗粒。     

湖南省葫芦科作物小西葫芦黄花叶病毒的检测

根据已报道的小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)保守序列设计了一对特异性引物,在58℃下退火30 s,建立了一种可靠、有效的ZYMV普通RT-PCR检测方法。通过该方法成功克隆出一条长度为621 bp的HC-Pro基因片段,并与杭州分离物的ZYMV辅助成分/蛋白酶(HC-Pro)基因核心区域(登录编号为AJ515911.1)的相似度达到99%。采用该方法对湖南省7个地区采集的疑似感病样品进行检测,结果显示:ZYMV平均阳性检出率达54.0%,说明ZYMV是侵染湖南省葫芦科作物的主要病毒之一。     

长沙地区南瓜的小西葫芦黄花叶病毒检测及其分子进化分析

对长沙地区160份南瓜疑似病毒病样品进行小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)检测,检出率达46.9%。为进一步明确长沙地区ZYMV分离物的分类地位和分子进化特征,克隆获得了1个长沙地区ZYMV外壳蛋白基因,与Gen Bank已报道的ZYMV外壳蛋白基因比对,并进行基因重组、系统发生、遗传差异、选择压力、种群结构和基因漂流分析。结果显示:长沙地区ZYMV外壳蛋白基因没有发生明显的重组,突变与负选择作用是其进化的主要驱动力,种群结构相对稳定,但正处于扩张的趋势中;ZYMV不同分离物外壳蛋白基因形成3个有明显地理相关性的美洲、欧洲和亚洲种群,美洲和欧洲种群与亚洲种群之间基因交流不频繁,可能受到遗传漂变的影响,而欧洲种群与亚洲种群之间基因交流较频繁。     

西瓜幼苗叶片对小西葫芦黄花叶病毒侵染的生理响应

为探明西瓜叶片对小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)侵染的生理响应机制。以感病品种18-025为材料,采用苗期常规汁液摩擦法接种ZYMV,比较分析了接种后2、4、6、8、10 d接与未接种叶片等生理指标的差异。结果表明,接种ZYMV后,叶片叶绿素、可溶性蛋白质含量均低于对照,其中,叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量在6～10 d时与对照差异达显著水平,可溶性蛋白质含量2～10 d时均与对照差异不显著;叶片脯氨酸、可溶性糖含量及3种保护酶活性均高于对照,其中脯氨酸含量在6、8、10 d时分别比对照显著提高21.92%、36.69%、58.01%,可溶性糖含量在4 d时比对照显著提高25.02%,超氧化物歧化酶活性在2～10 d时均与对照差异不显著;过氧化物酶活性在2、4、6、8 d时分别比对照显著提高46.76%、81.59%、48.74%、31.55%,过氧化氢酶活性在4、6、8 d时分别比对照显著提高23.93%、48.91%、46.15%;叶片丙二醛含量在2～6 d时高于对照,在8、10 d时低于对照,其中在6 d时比对照显著提高12.38%。综上说明,西瓜叶片叶绿素、脯氨酸、可溶性糖和丙...     

小西葫芦黄花叶病毒辽宁分离物的鉴定与序列分析

从辽宁省沈阳市和盖州市分别采集表现花叶的南瓜样品,经透射电镜负染色实验,观察到典型的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)线状病毒粒子.利用Potyvirus通用引物Legpoty F/LegpotyR分别对3个沈阳样品和3个盖州样品进行RT-PCR扩增,得到预期片段,克隆并测序.Blast显示6个病毒样本与小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)同源性最高,均大于99%.利用已经报道的特异引物ZYMV-F/ZYMV-R,从6个样本中扩增到约1.2 kb的ZYMV片段,片段包含完整的外壳蛋白(CP)基因.基于CP的核苷酸序列同源性分析,发现2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)同源性最高,达99.1%和99.4%.系统进化树分析表明,2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14]聚集在一个分支,推测ZYMV辽宁分离物与山西分离物亲缘关系最近.     

西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒中国株系遗传规律的研究

利用起源于非洲物高抗小西葫芦黄花叶病毒中国株系（ZYMV－CH）的西瓜野生种纯合自交系Egun为试材,对Egun与感病普通西瓜自交系9811,98R杂交的F1,F2和BC1等群体的抗病性接种鉴定与抗血清反应分析,发现抗ZYMVCH是由隐性单基因控制,这与Provvidenti在PI482261得出的抗小西葫芦黄花叶病毒佛罗里达株系（ZYMV－FL）的结果是一致的,但这两者是否是同一个基因还有待证实,现暂命名为zym-CH。     

小麦黄花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的衣壳蛋白(CP)基因,将其连接原核表达载体p EHISTEV,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达38 k D的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白,免疫新西兰长耳兔,制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048,Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应,而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。     

植物病毒源dsRNA原核表达条件的研究

利用PVYN-CP和PLRV-CP基因构建了dsRNA原核表达载体L4440RYl,转至大肠杆菌HT115(DE3),获得菌株HTRYl。绘制了菌株HTRYl的生长曲线,研究了IPTG浓度和诱导时间对该菌株dsRNA表达量的影响。结果表明,接种3.5h,菌体浓度OD600为0.6,加入终浓度为0.3～0.4mmol/L的IPTG,诱导4～5h时,dsRNA表达量最高。dsRNA表达条件的研究,为dsRNA的应用研究奠定了基础。     

小西葫芦黄花叶病毒在广西瓜类作物上的发生情况初报

用DAC—ELISA对广西各地瓜类作物病毒病样品448份进行小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)检测，结果表明：该病毒在广西瓜类作物上普遍发生，ZYMV阳性检出率为77．68％，西瓜、甜瓜、南瓜、西葫芦、黄瓜、苦瓜、瓠瓜和蛇瓜样品的阳性检出率在58．33％～100％之间，冬瓜、丝瓜样品的阳性检出率分别为20％和28．57％。ZYMV是侵染广西瓜类作物的主要病毒之一。     

小西葫芦黄化花叶病毒流行特征及防治策略

小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）主要通过蚜虫以非持久性方式传播，能侵染葫芦科、豆科等9科植物，近年来发现该病毒的发生危害有加重的趋势。通过对杭州地区该病毒的调查，描述了ZYMV的发生和流行特征，介绍了依靠农业措施及化学，生物等手段控制病害的防治策略。     

侵染南瓜的小西葫芦黄化花叶病毒的分离与鉴定

1999年秋在杭州一株表现典型黄化花叶的南瓜(Cucuribita moschata)上分离获得一株线状病毒HZ00s1.该病毒分离物在葫芦科作物(Cucuribitaceae)上引起系统症状.经寄主反应测定、病毒形态学和寄主组织病变观察, 初步确定该病毒为小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV).对ZYMV杭州分离物(HZ00s1)的外壳蛋白序列及3 端非编码区进行了克隆及序列测定,并与ZYMV Conneticut分离物、Florida分离物、California分离物以及WMV2 Tonga分离物进行了同源性分析.结果显示:HZ00s1分离物与其它3种ZYMV分离物CP基因核酸序列同源性为93%～94%,而与WMV2 Tonga分离物的同源性仅为67%,来自美国的3种ZYMV分离物之间的同源性高达95%～99%.HZ00s1分离物与其它3个ZYMV分离物CP氨基酸序列同源性在95%～98%之间.因此确定在杭州地区葫芦科作物上有ZYMV的发生.     

新疆小西葫芦黄化花叶病毒的分子鉴定与序列分析

在新疆石河子地区采集具有黄化、花叶和疱斑等症状的多种葫芦科作物,分别提取总RNA,利用小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)特异性引物进行RT-PCR扩增,其中来自黄瓜、甜瓜和丝瓜的模板RNA上可以得到1185bp片段。将扩增得到的片段克隆到pMD18-T上,序列分析结果表明:该片段含有1185个核苷酸,包含完整CP基因。与ZYMV Florida分离物、California、韩国KR-PA分离物、新加坡S及中国北京CH-BJ等GenBank报道的7个不同地域、不同种寄主植物上的分离物序列进行同源性分析的结果显示:ZYMV新疆分离物的CP基因核苷酸与其它11种ZYMV分离物的同源性高达99.42%,氨基酸序列同源性高达98.48%;新疆5个来源于不同寄主植物的ZYMV,不存在明显的遗传变异性,同源性高达97%,而与北京CH-BJ,Reunion和Singapore分离物相比存在较大差异,说明ZYMV地域的相关性要大于寄主上相关性。     

番木瓜环斑病毒CP基因dsRNA原核表达载体的快速构建

重点介绍了一种快速构建dsRNA原核表达载体的方法。以番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因（PRSV-CP）3＇端-279 bp保守区段为基础,通过OZ-LIC法构建861 bp,432 bp和279 bp 3种不同长度的发卡结构,再通过XhoⅠ和ClaⅠ双酶切,将其连接到pSP73原核表达载体上,构建成PRSV-CP基因dsR...     

4种原核表达双链RNA的dsRNA提取方法效果评价

[目的]构建表达不同片段长度和GC含量的dsegfp片段,比较4种dsRNA提取方法,获得最佳的提取方法以及dsRNA相对最优的表达载体,为dsRNA的降解研究提供基础.[方法]以pET-2p和L4440为载体,分别构建5组不同长度、不同CG含量的gfp-201-30CG、gfp-201-50-CG、gfp-423-3...     

甘蔗花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

将甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2的衣壳蛋白(coat protein,CP)基因分别克隆到原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP。将两个重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,均表达出分子量为38 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,免疫新西兰长耳兔5次,获得了SCMV-ⅠCP和SCMV-ⅣCP的多克隆抗体。间接ELISA结果表明,两种血清的效价均达到1∶8192。Western Blot结果表明,利用SCMV-ⅠCP制备的抗血清与DWK1反应更强,而利用SCMV-ⅣCP制备的抗血清与DWK2反应更强。本研究为SCMV检测及CP功能研究奠定了基础。     

源于马铃薯Y病毒CP基因的dsRNA原核表达及提取

以马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)为基础构建了含PVY CP基因3’端253bp反向重复片段的双链RNA(dsRNA)原核表达载体,并转化大肠杆菌HT115(DE3),经IPTG诱导产生dsRNA,用LiCl沉淀法提取,获得了高质量的dsRNA。