柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒(citrus vein enation virus,CVEV)侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer^?RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙(Citrus aurantium)、邓肯葡萄柚(C. paradisi)、尤力克柠檬(C.limon)、枳柚(C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙(P. trifoliata×C. sinensis)、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建...     

蜜蜂残翅病毒基因组全长克隆及其克隆不稳定性

利用长片段PCR技术,以单一病蜂的cDNA为模板,扩增出完整蜜蜂残翅病毒基因组并构建感染性克隆。结果表明,该基因组在某些大肠杆菌内难以稳定克隆,说明蜜蜂残翅病毒分离株具有克隆不稳定性,克隆不稳定性可能仅存在于部分蜜蜂残翅病毒分离株和亚型。国内的蜜蜂残翅病毒分离株在亲缘关系上非常接近,国外的蜜蜂残翅病毒分离株也可能存在克隆不稳定性。     

狂犬病病毒SRV_9株修饰全长基因组cDNA克隆的构建

为获得狂犬病病毒(rabies virus,RV)SRV9株的基因组全长cDNA克隆并对其进行基因修饰,深入研究狂犬病病毒的基因组特性及构建新型病毒载体,本研究根据GenBank中公布的SRV9基因组序列设计数对引物,以SRV9病毒为材料,从病毒总RNA中将全长基因组11 928 bp分5段扩增,克隆至载体测序鉴定。测序正确后,设计引物缺失基因组Ψ区并在缺失位置插入人细胞色素C基因,又设计引物删除糖蛋白(G)胞质区(CD区)。利用引物在病毒基因组起始处添加锤头状核酶序列,在病毒序列结尾处添加了丁型肝炎核酶序列。再次测序后克隆至pcDNA3.1(+)载体,利用扩增片段自身内切酶位点顺次进行修饰后全长连接,从而获得含修饰SRV9全长基因组的质粒pcDNA3.1-SRV9,为RV感染性克隆的建立奠定了基础。     

侵染贵州烟草的辣椒脉斑驳病毒鉴定及其基因组分子特征分析

【目的】明确辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus, ChiVMV)在贵州烟草上的发生情况及其与我国其他省份不同ChiVMV株系之间的遗传进化关系,为制定科学合理的防控措施提供依据。【方法】从贵州省贵阳、遵义、安顺和铜仁的烟田采集表现叶片斑驳、皱缩、坏死和花叶等症状的疑似病毒侵染的烟叶样品80份。采用RT-PCR法,设计多种病毒引物对所采集的样品进行检测,对检测出的ChiVMV进一步进行PCR分段扩增以获得贵州烟草ChiVMV的全基因组序列,基于NCBI已公布的所有ChiVMV基因组序列进行序列一致性分析并构建系统发育进化树,以研究贵州ChiVMV烟草分离株的遗传进化关系。【结果】RT-PCR检测结果显示,ChiVMV在贵州烟区检出率为37.50%,烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)检出率为48.75%,马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的检出率为35.00%,黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)检出率仅8.75%;检测出4种复合侵染类型TMV+PVY、PVY+ChiVM...     

柑橘黄化花叶病毒侵染性克隆构建及应用

【目的】构建柑橘黄化花叶病毒（citrus yellow mosaic virus,CYMV）侵染性克隆,为深入研究其分子特性及致病机理打下基础。【方法】利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接,构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析。将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗,通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性。利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物,通过RT-PCR检测确定侵染率,观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异。基于侵染性克隆构建ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein,gfp）的突变体,分析突变对病毒侵染性的影响。【结果】利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个。其中,CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90%—100%,与分离株CYMV-SO(AF347695)同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇。侵染性鉴定结果表明,CYMV-3接种的14...     

猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救

 【目的】建立猪瘟病毒研究技术平台,为进一步研究猪瘟病毒C株在细胞中的增殖机制及猪瘟病毒标记疫苗奠定基础。【方法】本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段,用合适的酶切位点连接,成功构建了C株全长感染性克隆pAC-CS。体外转录得到RNA,然后将其分别转染BHK-21和SK6细胞。拯救的病毒通过上清传代(常规病毒传代)和带毒细胞传毒繁殖。【结果】通过RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验和兔体发热试验检测,表明病毒拯救成功。经比较以电转的方式转染SK6的效果较好。通过带毒细胞传代,至12代时病毒滴度稳定达104TCID50?mL-1,而上清传代至第3代时用免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)不能检测出病毒。【结论】成功构建了猪瘟病毒C株感染性克隆;拯救C株时以SK6细胞电转较好;带毒细胞传代培养C株有利于获得较高滴度的病毒。     

新城疫病毒Lasota株基因组全长cDNA的构建与序列分析

将Lasota病毒RNA反转录为cDNA,按照GenBank上公布的Lasota基因组序列(AF 077761)设计了5对引物进行全基因组的扩增(RT-PCR),并将各个片段连于克隆载体pMD_(18)-T,获得高拷贝的基因序列,然后通过酶切连接将测序正确的各个片段连接到pET-30a载体。PCR分片段扩增、酶切鉴定及测序结果表明,所构建的Lasota全基因组cDNA基因序列正确,连入载体的位置与预期完全一致。     

利用酵母同源重组系统快速构建柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆

【目的】构建柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaf blotch virus,CLBV）中国分离株的侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】以GeneArt® pYES1L Vector为模板,PYES2117F、PYES2117R为引物扩增含有酵母相关复制起始位点的片段pYES1L-2117,利用限制性内切酶Sac II单酶切双元载体DK1317-2并回收其大片段,利用In-Fusion HD Cloning Kit重组连接双元载体DK1317-2骨架和片段pYES1L-2117,得到可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中复制的三元穿梭载体pCY。以马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)全长cDNA侵染性克隆为模板,pCY-PVX-F、pCY-PVX-R为引物扩增PVX全长,采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切质粒pCY,采用醋酸锂转化法将获得的PVX基因组全长cDNA与线性化的pCY载体共转化酵母菌YPH501,通过同源重组获得PVX基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导接种本生烟验证所构建克隆的侵染性,从而建立基于酵母同源重组的病毒侵染性克隆快速构建体系。在此基础上,以CLBV中国分离物（CLBV-HBYD）全长cDNA为模板,分段扩增其基因组,得到片段CLBV-1、CLBV-2;利用所建体系对CLBV-1、CLBV-2及pCY载体片段进行同源重组。得到重组质粒pCY-CLBV后,经农杆菌介导接种本生烟和锦橙幼苗,并利用RT-PCR和Northern blot检测其侵染性。【结果】建立了酵母-大肠杆菌-农杆菌的三元穿梭载体PCY,该载体全长10 347 bp,含有酵母、农杆菌、大肠杆菌的复制位点,能在酵母-农杆菌-大肠杆菌稳定复制,可用于在酵母中通过同源重组快速构建病毒基因组全长cDNA克隆,也可用于通过农杆菌介导直接接种植物寄主。利用该体系获得了CLBV中国分离株的基因组全长cDNA克隆16个。随机选取1个克隆进行了序列测定（GenBank登录号：MG572236）,其基因组全长8 747 nt,包含3个开放阅读框(open reading frame,ORF),ORF1为5 889 nt、ORF2为1 089 nt、ORF3为1 092 nt。全基因组序列比对显示,CLBV-HBYD与已登录的9个CLBV分离物的核酸序列一致性为79％-98％,其中与柑橘来源的EU857540一致性最高,为98%,与猕猴桃来源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均为79%。在利用MEGA6 软件构建的系统发育树上,CLBV-HBYD与柑橘来源的CLBV分离株聚为一簇,而猕猴桃来源的CLBV分离株聚为另一簇。将所获16个CLBV全长cDNA克隆转化农杆菌,以pCY空载体为阴性对照注射接种本生烟。接种20 d后,抽提RNA进行RT-PCR检测,结果表明11个克隆的接种植株检测出CLBV特异性条带;随机选取5个阳性克隆进一步进行了Northern blot杂交,结果显示pCY-CLBV 1、2、3、14、15接种的本生烟可以检测到CLBV特异性条带,而对照样本未检测到任何条带,表明这些克隆均为侵染性克隆。【结论】构建了基于三元穿梭载体pCY的酵母重组克隆体系,利用该体系获得了中国CLBV分离株的适于农杆菌介导接种的基因组全长cDNA侵染性克隆。     

辣椒CaMAPK7的全长cDNA克隆及其表达分析

以辣椒均一化cDNA文库为模板,通过特异性引物的PCR扩增,获得CaMAPK7全长cDNA序列,该序列含有1个370个氨基酸序列的开放阅读框,与拟南芥等其他植物具有84%-97%的氨基酸同源性。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在辣椒的根、茎和叶中均有不同程度的组成型表达,在根部的表达最高,在叶片中该基因的表达受到青枯菌侵染、高温等逆境及水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯等外源激素处理的诱导,但脱落酸处理使其表达下调。这些结果表明CaMAPK7可能在辣椒应答青枯病和高温等逆境胁迫中起着重要的作用。     

美洲水貂DQA基因全长cDNA克隆及其生物信息学分析

参考NCBIGenBank中上传的雪貂、海獭DQA基因序列设计出RT-PCR扩增引物,克隆了美洲水貂DQA基因全长cDNA序列;利用生物信息学软件构建了 DQA基因系统进化树,预测了 DQA蛋白结构与功能.结果表明:DQA基因全长cDNA序列大小为1 147 bp,ORF序列为768 bp,编码255个氨基酸,存在23...     

草鱼CRP基因全长cDNA的克隆及其表达分析

利用草鱼C-反应蛋白(CRP)的EST序列(CK233056)设计引物,采用快速扩增cDNA末端(SMART-RACE)的方法克隆CRP基因的5′末端,获得1个约520 bp的cDNA片段.将该片段与EST拼接,得到CRP基因全长cDNA,长度为889 bp,含有1个672 bp的开放阅读框,两侧分别有74 bp和143 bp的5′和3′非翻译区域(open reading frame, ORF),CRP基因编码224个氨基酸残基,N端含有15个氨基酸残基的信号肽.利用RT-PCR半定量法对健康及被嗜水产气单胞菌人工感染的草鱼的心脏、脑、前肠、肾脏、肝胰脏、肌肉、脾等组织CRP的mRNA表达水平进行检测,结果表明,CRP基因在7种组织中均有表达,表达水平差异不明显.在人工感染24 h后,各组织中CRP的mRNA水平平均升高5倍左右,与哺乳动物和一些鱼类在炎症反应中血清CRP水平升高一致,而人工感染48 h后,除心脏和肌肉组织中有显著降低外,其他组织没有明显变化,仍维持较高水平.     

新城疫病毒SD强毒株全长cDNA克隆的构建及序列分析

将新城疫病毒SD强毒株的全基因组cDNA序列进行分段扩增,并将各个片段通过In-Fusion技术连于克隆载体pBR322上,获得了SD毒株的全基因组cDNA克隆。通过分段PCR扩增鉴定及全长测序分析,结果表明,SD毒株的全基因组cDNA克隆构建成功,并且成功引入T7启动子序列,全长基因组序列与亲本毒氨基酸序列的一致性为99.9%。单个序列比对发现,全基因组cDNA克隆中有11处碱基突变,其中只有2处引起氨基酸序列发生改变;整个序列未出现基因的缺失、插入变化,因此全长氨基酸的位数未发生任何变化。SD毒株全长cDNA克隆的成功构建和序列分析为后续的反向遗传操作奠定了关键的技术基础。     

樱桃谷鸭OASL基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析

为了获得樱桃谷鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白质基因(OASL)全长cDNA,并且初步了解其生物学特性,采用RT-PCR和RACE方法从鸭脾脏组织总RNA中扩增OASL基因cDNA片段,应用生物信息学方法,系统分析鸭OASL的遗传进化以及蛋白质的理化性质、二级结构和亚细胞定位。结果表明,樱桃谷鸭OASL基因(Gen Bank登录号:KX255654)全长1 630 bp,其中包含19 bp的5'UTR(Untranslated region,UTR)、99 bp的3'UTR(Untranslated region,UTR)和PolyA尾巴、1 512 bp的编码区(Coding region,CDS),翻译编码504个氨基酸多肽。鸭OASL蛋白具有寡腺苷酸合成酶(OAS)蛋白家族的典型特征,即N端为寡腺苷酸合成酶样结构域(OAS-like domain,OLD),C端为2个串联的泛素化样结构域(Ubiquitin-like domains,Ub LDs),不具有信号肽和跨膜区。序列比对和系统进化分析结果表明,OASL氨基酸序列在同种之间比较保守,与已报道的鸭OASL的同源性高达100%,与鹅同源性为78%,与人、鼠和猪等哺乳动物的同源性仅为43%~45%。     

番茄黄化曲叶病毒(TY)侵染性克隆接种鉴定方法研究

采用YEP1和YEP2培养基培养番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆pBinPLUS-1.7A＋2β,并用固体菌落、液体菌菌液浓度OD600≈0.6、液体菌菌液浓度OD600≈1.0对感病番茄品种MM、中蔬4号、98-B1在4~6叶苗期进行接种处理。结果显示,2种液体培养基的液体菌菌液浓度为OD600≈0.6时接种处理发病率较高,并初步确立了无TY发病地区侵染性克隆接种鉴定方法。     

鲤鱼白细胞介素-1β全长cDNA的克隆·鉴定及其差异表达分析

[目的]进行鲤鱼白细胞介素-1β（IL-1β）全长cDNA的克隆、鉴定及其差异表达分析。[方法]利用DD-RTPCR方法获得差异表达cDNA片段,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行筛选,克隆了鲤鱼IL-1β的全长cDNA,并进行了序列分析和差异表达分析。[结果]获得的阳性克隆含有1个大小为831 bp编码276个氨基酸的完整开放阅读框。聚类分析表明,鲤鱼IL-1β氨基酸序列与日本鲤鱼紧密聚为一支,氨基酸序列的同源性达95%,之后聚类顺序依次为鲫鱼、斑马鱼、猪、牛、马、人和小鼠。差异表达分析表明,经有丝分裂原刺激后前期（4 h）白细胞中IL-1β的表达量显著增大,但随着时间推移（12,24 h）并非一直较同期大,表达量总体趋势成峰形。[结论]为进一步研究IL-1β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应、应急反应和免疫应答的作用机制奠定了基础。     

松材线虫actin基因全长cDNA的克隆

借助电子克隆和RACE方法,克隆了松材线虫生长发育关键基因actin的全长cDNA序列(登陆号:EU100952)。该序列共1 296个碱基,有一个完整ORF,起始密码子在48位,终止密码子在1 176位,编码376个氨基酸。     

传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB-bp)基因组A节段全长cDNA的克隆和序列分析

采用RT-PCR技术,以传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB-bp)基因组RNA为模板,扩增并克隆了IBDVHB-bp株基因组A节段全长cDNA。结果表明:克隆的A节段全长共3142个核苷酸,包括5′、3′端非编码区(NCRs)和2个部分重叠的开放阅读框(ORF1和ORF2),与其它血清Ⅰ型毒株相比,HB-bp株在核苷酸水平上有32～146个核苷酸的差异,同源性为95 4%～98 8%;在氨基酸水平上有5～35个氨基酸的替代,同源性为96 9%～99 5%,与血清Ⅱ型毒株同源性为89 8%～90 8%。与其他超强毒株的同源性最高,具有超强毒株的特征性氨基酸,因此HB-bp株为中国的一个超强毒株。     

牙鲆lin-29基因的全长cDNA克隆、鉴定及其在早期发育中的表达分析

通过PCR技术,从牙鲆(Paralichtys olvaceus)总RNA中获得牙鲆lin-29基因c DNA序列,该序列全长1 769 bp,包括1 329 bp开放阅读框,编码442个氨基酸,预测其是一种多锌指结构蛋白;氨基酸序列对比分析显示,牙鲆LIN-29与大黄鱼(Larimichthys crocea)的同源性最高,达95.25%;系统进化树分析表明,牙鲆与其他鱼类聚集一支,并且与罗非鱼的进化关系最近。荧光定量PCR显示,在牙鲆胚胎和仔鱼发育阶段,以原肠胚期lin-29表达量最高;组织表达分析表明,脑中表达最高,肌肉中最低。外源甲状腺激素(TH)在牙鲆仔鱼发育初期(TH处理后2 d、5 d)下调lin-29表达,TH处理后21 d(36 dph)和26 d(41 dph)上调lin-29基因表达,同时,硫脲(TU)处理均显著上调lin-29表达。结果显示牙鲆lin-29基因可能在牙鲆早期发育过程中扮演着重要的角色,为进一步研究lin-29在牙鲆生长发育中的功能奠定基础。