莲藕多酚氧化酶互作蛋白的筛选及验证

【目的】以中国莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）的多酚氧化酶家族成员之一NnPPO1（GenBank: ADC92563.1）为研究对象,筛选、验证与其互作的蛋白,为深入研究莲藕PPO的分子作用机制、精准抑制其活性奠定基础。【方法】利用酵母双杂交（Y2H）技术,验证莲藕抗氧化酶是否与NnPPO1存在互作关系。通过转化酵母试验检测互作蛋白过氧化氢酶同工酶NnCAT1（GenBank:XP_010242894.1）的毒性和自激活活性。构建双分子荧光标记试验（BiFC）所用的35S-NnPPO1-SPYNER173、35S-NnCAT1-SPYCEM表达载体,通过农杆菌介导法,将重组质粒转化烟草,进一步验证NnPPO1与NnCAT1之间的互作关系。根据NnPPO1和NnCAT1的结构域截短蛋白,寻找互作关键结构域。利用PlantCARE分析NnPPO1与NnCAT1启动子相关作用元件,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析NnPPO1与NnCAT1在莲藕不同组织中的表达水平。采用同源重组的方法构建35S-NnCAT1-GFP融合蛋白表达载体,用于亚细胞定位分析。运用DNAMAN软件对NnCAT1序列和其他物种序列进行多序列比对。运用生物信息学网站对NnCAT1进行理化性质与结构分析。【结果】NnCAT1与NnPPO1存在蛋白互作,且NnCAT1蛋白无自激活作用,对酵母菌株也没有毒性。在细胞膜和细胞核上观察到黄色荧光信号,进一步证实NnPPO1与NnCAT1之间存在互作。NnPPO1的酪氨酸酶结构域在蛋白互作中发挥主要作用。NnPPO1与NnCAT1启动子序列上存在多种顺式调控元件,如光响应元件Box 4、GT1-motif、TCT-motif,逆境响应元件ARE以及激素响应元件CGTCA-motif、TGACG-motif等。NnPPO1与NnCAT1的表达模式基本相同,在各组织中均有表达,均在叶中表达量最高,在茎尖中表达量最低。亚细胞定位结果显示NnCAT1定位于细胞膜和细胞核中。莲藕NnCAT1的相对分子质量约为57.0 kD,理论等电点（PI）为6.93;该蛋白为同源四聚体亲水性蛋白质;无跨膜结构和信号肽,存在叶绿体转运肽,前21 aa为转运肽区域;二级结构由27.64%的α-螺旋、15.65%延长链、6.30%β-转角和50.41%无规则卷曲构成。【结论】筛选出NnCAT1与NnPPO1之间存在蛋白互作,用BiFC进一步证实两者互作的真实性,NnPPO1保守的酪氨酸酶结构域在互作中发挥主要作用;NnPPO1与NnCAT1的表达模式基本相同,推测NnPPO1与NnCAT1协同互作导致莲藕等果蔬褐变。     

茶树CsHIPP26.1互作蛋白的筛选与验证

【背景】‘黄金芽’属于光照敏感型黄化茶树（Camellia sinensis）品种,叶片色泽呈现强光黄化、弱光复绿的特点,但叶色响应光照的黄化机制并不明确。前期通过对黄化叶片、遮阴复绿叶片以及常绿品种叶片的蛋白组研究发现,重金属相关异戊二烯化植物蛋白CsHIPP26.1（TEA000549）的表达响应光照强度,表明CsHIPP26.1可能参与调控‘黄金芽’叶色黄化的光响应过程。【目的】通过筛选与CsHIPP26.1互作的光信号响应相关的蛋白,为叶片色泽响应光照信号变化提供科学依据。【方法】以‘黄金芽’茶树1芽2叶为材料进行CsHIPP26.1和互作基因的克隆,经酵母双杂交筛库,然后将筛选得到的目的蛋白进行酵母双杂交点对点验证、体内双分子荧光互补（BiFC）和体外pull-down等技术进行蛋白互作的进一步验证。【结果】通过酵母双杂交对茶树cDNA文库进行筛选,共筛选到26个候选互作蛋白,主要集中在细胞组分、结合以及催化活性方面发挥作用,其中生物素合成代谢过程富集程度较高,与光信号通路及叶绿素合成相关的蛋白只有编号为TEA026466.1的bHLH30转录因子。克隆bHLH30转录因子后发现,该转录因子与茶树光信号传导途径蛋白PIF4处于同一进化树分支,且含有与茶树PIF4蛋白相同的HLH和ACT结构域,将该bHLH30转录因子命名为CsPIF4.2,GenBank登记号为MW116834。进一步通过体外Pull-down蛋白互作和体内双分子荧光互补（BiFC）验证发现,CsHIPP26.1和CsPIF4.2蛋白能够发生互作,并且发生互作的部位在细胞核内。【结论】初步筛选出26个与CsHIPP26.1互作的蛋白,并验证发现CsHIPP26.1能够在细胞核内与其中一个光敏色素互作因子CsPIF4.2发生蛋白相互作用。     

小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。     

莲藕多酚氧化酶的催化特性检测

本试验以冰浴研磨离心法制备莲藕多酚氧化酶酶液,用分光光度法系统的研究了pH值、温度、底物浓度、抑制剂对酶活性的影响.结果表明,以邻苯二酚为底物,莲藕多酚氧化酶的最适pH为7.0,最适温度为20℃;KM为0.18mol/L,Vmax为0.900OD/min;抗坏血酸和硫脲为强烈抑制剂;莲藕多酚氧化酶具有底物专一性.     

莲藕多酚氧化酶的酶学特性

鲜切莲藕褐变一直是生产中急待解决的关键问题。莲藕的护色主要表现为对组织中多酚氧化酶 (ＰＰＯ)活性的控制。ＰＰＯ是大多数果蔬中普遍存在并引起组织酶促褐变的一类氧化还原酶[1] 。鲜切果蔬由于组织经切分等使ＰＰＯ与底物的接触机会增加 ,加速了褐变反应 ,影响产品质量及     

莲藕中多酚氧化酶特性的研究

为解决带肉莲藕汁加工中褐变问题，采用分光光度法对莲藕组织中多酚氧化酶的特性进行了研究，分别求出该酶的最适温度为３０℃，最适ｐＨ为５．０和７．０，Ｖ＿（ｍａｘ）＝１．３２吸光度／ｍｉｎ，Ｋ＿ｍ＝２０ｍｍｏｌ／Ｌ。并探讨了该酶的热稳定性特征和抑制剂ＳＯ＿２。Ｖｃ对酶活力的影响，９５℃条件下１８ｓ可将酶灭活，抑制剂的有效抑制浓度分别为０．６％（ＮａＨＳＯ＿３计）和１．０ｍｏｌ／Ｌ（Ｖｃ）。     

莲藕中多酚氧化酶特性的研究

为解决带肉莲藕汁加工中褐变问题，采用分光光度法对莲藕组织中多酚化酶的特性进行了研究，分别求出该酶的最适温度为３０℃，最适ＰＨ为５．０为７．０，Ｖｍａｘ＝１．３２吸光度／ｍｉｎ，Ｋｍ＝２０ｍｍｏｌ／Ｌ。并探讨了该酶的热稳定性特征和抑制剂ＳＯ２，Ｖｃ对酶活力的影响。９５℃条件下１８ｓ可将酶灭活，抑制剂的有效抑制浓度分别为０．６％（ＮａＨＳＯ３计）和１．０ｍｏｌ／Ｌ（Ｖｃ）。     

ZmCIPK8互作蛋白CBLs的筛选

利用酵母双杂交技术,以PGBKT7-ZmCIPK8载体为诱饵质粒,筛选能与ZmCIPK8互作的CBLs蛋白.结果表明,ZmCBL1,4,9能够与ZmCIPK8相互作用.表达分析结果为进一步研究ZmCIPK8与ZmCBL1,4,9在植物体内的相互作用提供了又一证据,这为深入解析ZmCIPK8参与逆境胁迫的作用机制奠定了基础.     

长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2互作蛋白的筛选与验证

【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术,对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进行筛选、鉴定和分析,并采用酵母双杂交试验验证了CbuqPBP2与信息素结合蛋白CbuqPBP1的特异性互作。【结果】GST pull-down共筛选出45个与长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2特异性结合的候选互作蛋白,包括CbuqPBP1、ND2、CYTB。这些互作蛋白主要参与细胞过程、定位、代谢过程、应激反应以及生物调控等多个生物学过程。使用酵母双杂交体系,构建了pGADT7-PBP1 重组猎物质粒与pGBKT7-PBP2 重组诱饵质粒,通过诱饵质粒毒性检测和自激活检测,表明重组诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无毒性作用。共转化验证结果显示,诱饵质粒pGBKT7-PBP2共转化酵母菌株能够在TDO 培养基上生长。【结论】CbuqPBP2和CbuqPBP1之间有相互作用,不同信息素结合蛋白间的互作对深入理解长足大竹象嗅觉感受机制提供了新的思路。     

马铃薯StRab互作蛋白的筛选与分析

为了进一步探讨StRab蛋白在马铃薯晚疫病抗性中的作用机制,采用酵母双杂交技术,以StRab蛋白为诱饵,对马铃薯晚疫病菌诱导表达的cDNA文库进行筛选。通过验证、测序和比对等分析,获得了26个候选克隆,其中支架蛋白、多聚泛素、蛋白酶抑制子、ERF转录因子、多酚氧化酶、几丁质酶等均与植物逆境胁迫有关。说明StRab蛋白在马铃薯晚疫病抗性的信号途径中有重要作用。     

葡萄VvGCN5基因的鉴定及互作蛋白筛选

[目的]本文旨在揭示组蛋白乙酰转移酶GCN5(general control non-repressible 5)在葡萄生长发育过程中的调控机制,并筛选出与VvGCN5互作的蛋白,以期为进一步构建VvGCN5在葡萄生长发育中的调控网络提供理论基础。[方法]利用生物信息学技术对VvGCN5的蛋白二级结构、基因结构、功能域、启动子的顺式作用元件以及抗逆的表达量和时空表达进行分析,并在烟草中进行亚细胞定位,研究VvGCN5表达位置。通过酵母双杂交技术筛选与VvGCN5互作的蛋白,并通过双分子荧光互补(BIFC)技术进行验证。[结果]VvGCN5的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠以及无规则卷曲构成,含有10段内含子序列和11段CDS序列,具有Acetyltransf＿1和Bromodomain结构域,以及ARE、GT1-motif、TGACG-motif、CAT-box、CGTCA-motif等顺式作用元件。通过查询GEO数据库发现VvGCN5可能受到光照和灰霉病的影响。VvGCN5主要表达于葡萄的成熟茎、萌芽初期、心皮、种子中。亚细胞定位发现VvGCN5位于细胞核和细胞膜上。此外,以pG...     

水稻OsZFP互作蛋白的筛选与鉴定

CCHC型锌指结构蛋白Os ZFP参与调控水稻Oryza sativa侧根的生长发育,但其相关互作蛋白及调控机制未知。以水稻‘日本晴’‘Nipponbare’为试验材料,克隆了Os ZFP基因,利用Eco RI和Sal I酶切位点构建酵母双杂交钓饵表达载体p GBKT7+Os ZFP,验证该表达载体对酵母菌株Y2H无毒性及报告基因自激活现象;采用酵母双杂交技术,从已构建的水稻c DNA文库中筛选到1个阳性互作蛋白,经美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)同源性比对,鉴定为含有T-complex polypeptide 1(TCP-1)结构域的分子伴侣蛋白第7个亚基(Os06g0687700),命名为chaperonin containing TCP-1 eta subunit(CCT-eta),进而通过酵母一对一回复验证该互作蛋白。基于CCT-eta亚基与Os ZFP蛋白互作,推测分子伴侣蛋白亚基CCT-eta可能参与调控水稻侧根的生长发育。     

小麦多酚氧化酶(PPO)活性的SSR标记筛选与验证

小麦多酚氧化酶(PPO)活性是引起面条和面团储存期间颜色褐变的主要因素。发掘可应用于籽粒PPO活性辅助选择的分子标记，将有助于小麦面粉颜色性状的遗传改良。本研究选用来自全国不同麦区的203份冬小麦品种，验证SSR(simple sequence repeat)引物Xgwm312的PCR扩增片段大小与籽粒PPO活性的关系。结果表明，198bp扩增片段的有无同籽粒PPO活性大小密切相关，该片段的出现通常意味着籽粒PPO活性较高。Xgwm312可应用于籽粒PPO活性的分子标记辅助育种。     

OsCPK12基因功能研究和互作蛋白筛选

通过反向遗传学研究方法,构建OsCPK12基因敲除和超表达突变体,用150 mmol/L的NaCl进行盐胁迫处理,结果显示:超表达株系无论株高、根长还是叶片状态都优于野生型,而基因敲除突变体相比于野生型株高明显矮化,根的发育形态差,叶片枯黄,证实OsCPK12对水稻耐盐有正调控作用。用real-time PCR对突变体株系的根、叶鞘、叶片多个部位的激素信号转导路径基因的表达量进行分析,结果显示:超表达株系的多个激素受体编码基因和下游调控基因表达量显著上调,说明OsCPK12参与激素的信号转导并影响水稻抗逆反应。为进一步研究OsCPK12的基因功能,通过在水稻原生质体中表达融合蛋白进行OsCPK12的亚细胞定位,确定OsCPK12定位于质膜。用酵母双杂交的方法在水稻中花11膜蛋白文库中筛选到2个水通道蛋白OsPIP1-1和OsPIP2-7,且酵母点对点验证为阳性,推测OsCPK12可能通过与OsPIP1-1和OsPIP2-7互作,调控水分子进出细胞,提高了水稻的耐盐性。     

应用酵母双杂交系统筛选GbVWR互作蛋白

前期研究表明海岛棉(Gossypium barbadense)GbVWR(Verticillium wilt resistance)基因参与了棉花抗黄萎病反应,但其抗病机制尚不清楚。本试验利用酵母双杂交系统筛选GbVWR互作蛋白,并通过对互作关系的分析初步探讨其介导的棉花抗病机制。结果表明:本研究成功构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-GbVWR,并利用PEG/LiAc法将其转化至酵母菌株Y2HGold感受态细胞中,结果显示重组质粒无自激活活性及毒性;用携带诱饵载体pGBKT7-GbVWR的酵母菌株与黄萎病诱导的海岛棉Pima90-53酵母双杂交cDNA文库进行杂交,通过PCR、测序和数据库比对分析插入的基因片段,共筛选到24个与GbVWR潜在互作的蛋白,为进一步探明GbVWR的抗病功能提供了理论依据。     

酵母双杂交筛选小麦TaMBD2互作蛋白

为探讨小麦甲基结合域蛋白(TaMBD2)在植物生长发育过程中的调控功能,以TaMBD2基因的全长cDNA为模板,构建诱饵载体pGBKT7-TaMBD2,利用酵母双杂交系统从小麦cDNA文库中筛选TaMBD2互作蛋白。结果共筛选到91个菌斑显蓝色的克隆,对其进行菌液PCR检测并测序,然后在NCBI上进行BLAST比对分析,共获得8个可能与TaMBD2互作的蛋白,分别为二磷酸核苷激酶(NDPK)、ENTH结构域蛋白、SIAN蛋白、Agenet结构域蛋白、C2H2型锌指蛋白、磷酸激酶和2个假定蛋白,其中最有可能的TaMBD2互作蛋白为NDPK。这些候选蛋白主要参与细胞信号传导、抗逆、能量代谢和蛋白质运输等。其中,检测结果中参与植物抗逆胁迫的蛋白质为主要互作蛋白,所占比例为54.9%;参与蛋白质运输的互作蛋白所占比例为25.3%,其余互作蛋白所占比例较小。因此,推测TaMBD2可能主要参与植物对干旱、低温和高盐等非生物胁迫逆境的响应及调控。     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

拟南芥NBS1互作蛋白的筛选和鉴定

【目的】筛选拟南芥中NBS1的互作蛋白,探究NBS1蛋白的新功能,为后续研究奠定基础。【方法】利用酵母双杂交技术筛选拟南芥c DNA文库,对得到的序列进行BLAST比对、亚细胞定位分析和基因本体注释。【结果】共有221个阳性克隆,测序后通过BLAST比对得到97个与NBS1互作的蛋白,包括膜蛋白、转运蛋白和折叠蛋白等,它们主要定位于细胞质、细胞核和叶绿体等,主要富集于4个分子功能、5个细胞组分和13个生物过程。【结论】拟南芥中与NBS1互作的蛋白在刺激响应、信号转导和细胞代谢等方面发挥着重要作用,也证明NBS1是一种多功能蛋白,但其功能及分子机制还需进一步研究。     

小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选

 【目的】利用酵母双杂交技术从小麦cDNA文库中筛选TaDREB6互作蛋白,进一步研究DREB介导的小麦抗逆机制。【方法】以小麦的cDNA为模板扩增得到TaDREB6,构建小麦cDNA文库和pGBKT7-TaDREB6诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaDREB6以及pGADT7和cDNA文库混匀转入AH109酵母感受态细胞,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基上,30℃培养3—5 d,挑取平板上直径大于2 mm的菌落,进行显蓝筛选。【结果】对筛选到的102个候选阳性克隆进行测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与能量代谢、抗逆和防御、转运、转录和翻译、信号转导以及生长发育等相关的候选蛋白。【结论】筛选得到候选蛋白的功能预测表明TaDREB6可能参与了多条信号转导途径,在抗逆境调控中具有重要作用。     

稻瘟病菌MoYpt7互作蛋白的初步筛选

利用酵母双杂交系统,以稻瘟病菌MoYpt7激活型为诱饵蛋白,从稻瘟病菌不同生长发育阶段的cDNA文库中筛选互作蛋白,经复筛得到10个候选互作蛋白基因,利用Bi FC或pull-down assay验证蛋白间的互作,为寻找MoYpt7下游调控侵染致病过程的效应因子提供依据.