杉木磷转运蛋白基因ClPht1;1的克隆及表达分析

【目的】PHT1基因家族是影响植物吸收磷营养的重要磷转运子之一。从杉木32号磷高效家系c DNA中克隆得到PHT1基因家族的1个杉木磷转运蛋白基因ClPht1;1,并对不同程度磷胁迫下ClPht1;1的时空表达进行研究,为杉木PHT1基因序列特征和功能结构的研究以及磷高效利用杉木基因型的选育奠定基础。【方法】根据PHT1基因家族序列保守性设计简并引物,以32号磷高效杉木基因型根系c DNA为模板进行扩增获得目的基因ClPht1;1的c DNA序列,使用RACE技术对目的基因进行全长克隆,并对其序列特征、同源性和编码磷转运蛋白结构进行分析。实时荧光定量PCR检测ClPht1;1在32号磷高效杉木家系根、茎、叶中的表达,检测中度缺磷胁迫下ClPht1;1在不同磷利用效率杉木4号、15号、25号、27号、28号、32号家系根系中的表达差异,以及在中度、重度缺磷胁迫下ClPht1;1在32号磷高效杉木家系根系中随时间序列的表达量变化。【结果】克隆得到1个杉木磷转运蛋白PHT1基因,命名为ClPht1;1(Gen Bank登录号:KX302006),基因序列编码区长1 638 bp,编码545 aa的蛋白质。ClPht1;1所编码蛋白质由12个疏水的跨膜区域组成,1个疑似跨膜域。每个跨膜结构域基本由17~25个氨基酸残基组成螺旋,同时跨膜蛋白的N端和C端均位于细胞质内,保守序列位于第4个跨膜域。构成蛋白质的主要骨架是α-螺旋,无信号肽序列。ClPht1;1基因编码蛋白与日本柳杉PHT基因编码蛋白的氨基酸序列相似性达到87.0%,与胡杨、油茶、马尾松等PHT家族基因编码蛋白的氨基酸序列相似性均在75%以上。ClPht1;1基因在杉木的根、茎、叶组织中均有表达,其中在根中的表达量最高,在叶中的表达量最低。在中度缺磷胁迫下,ClPht1;1基因在杉木不同家系根部的表达量为25号27号4号15号32号28号。在中度和重度缺磷胁迫下,ClPht1;1基因在32号杉木家系根部的表达量随胁迫时间的延长而逐渐上升;恢复供磷后,ClPht1;1基因表达量逐渐下降至正常水平;重度缺磷胁迫下,ClPht1;1基因表达量要高于其在中度缺磷胁迫下的表达量。【结论】ClPht1;1基因具有PHT1基因家族的典型结构,其编码蛋白的氨基酸序列与日本柳杉等磷转运蛋白氨基酸序列具有高度相似性,为杉木高亲和磷转运蛋白PHT1基因家族成员。ClPht1;1基因主要在杉木的根部表达,在叶片中的表达量较低;杉木磷利用效率越强,ClPht1;1基因在其根部的表达量越高。在不同磷利用效率的杉木家系中ClPht1;1基因表达量存在较大差异。ClPht1;1基因的表达受低磷胁迫的诱导,缺磷胁迫下ClPht1;1基因表达量明显升高,恢复供磷后ClPht1;1基因表达量明显降低。     

2个野扁桃自交不亲和SFB基因全长的克隆与序列分析

为给野扁桃的遗传改良和自交不亲和机制的进一步研究提供理论依据,以新疆野扁桃花药为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆野扁桃自交不亲和性花粉特异性决定因子编码基因SFB全长序列。采用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,CDD分析蛋白保守结构域,Prot Param分析蛋白理化性质,TMHMM预测蛋白跨膜区,Signal P预测蛋白信号肽,Sub Loc预测蛋白亚细胞定位,SOPMA分析蛋白二级结构,DANMAN进行氨基酸多序列比对,MEGA6进行系统进化分析,Prot Fun预测蛋白功能。结果表明:克隆到的Pt SFB16基因和Pt SFB17基因属于F-box基因家族,与其它多种植物的SLF/SFB基因的序列相似度为88%,推导的氨基酸序列均具有F-box蛋白典型结构;Pt SFB16基因ORF长1 146 bp,编码381个氨基酸,Pt SFB17基因ORF长1 131 bp,编码376个氨基酸;预测2个SFB蛋白均为略显亲水性、不稳定的细胞质蛋白,二级结构均以α-螺旋,延伸链和无规则卷曲为主,SFB/SLF蛋白在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,种间同源性可能大于种内同源性,SFB蛋白可能的功能主要有辅助因子生物合成、能量代谢和裂合酶。     

暴马桑黄SbLSD基因克隆及差异表达分析

【目的】暴马桑黄是一种重要的药用资源,三萜是其发挥药用功效的主要成分,但是目前获取大量三萜仍然非常困难。通过对暴马桑黄三萜合成途径中的羊毛甾醇14α-脱甲基酶(lanosterol 14-alpha-demethylase,LSD)基因进行克隆及差异表达分析,以期深入了解暴马桑黄三萜合成的调控机理,进而提高三萜产量。【方法】采用PCR扩增得到LSD基因cDNA序列全长,利用生物信息学软件对该基因编码的氨基酸序列进行分析;采取同源重组方法构建原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,SDS-PAGE检测;qRT-PCR技术分析LSD基因在暴马桑黄不同发育阶段转录水平差异。【结果】暴马桑黄LSD基因cDNA全长1 662 bp,编码553个氨基酸,相对分子量为62.26 kDa,命名为SbLSD(登录号为MN864180);跨膜区和亚细胞定位预测显示SbLSD蛋白是在内质网和高尔基体发挥作用的跨膜蛋白;系统进化树结果表明暴马桑黄和灵芝的LSD蛋白同源性最高,符合物种经典分类;SDS-PAGE结果证实在62.26 kDa附近出现目的蛋白条带,说明所获得的基因可以成功表达出蛋白;从荧光定量分析结果中可以看出SbLSD基因转录水平在不同发育阶段有差异性,并且在子实体阶段该基因转录水平最高,与羊毛甾醇合成的基因变化规律相吻合。【结论】通过对SbLSD基因的分子鉴定解析,为进一步揭示该基因在暴马桑黄三萜合成途径中的功能奠定基础。     

杨树HSP90基因的克隆及生物信息学分析

【目的】为了揭示热激蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)基因在杨树抗溃疡病中的功能,克隆获得毛白杨HSP90基因的全长序列,以期明确HSP90基因的表达与溃疡病菌侵染间的关系。【方法】采用RT-PCR技术和Gateway克隆的方法,获得了毛白杨的HSP90基因序列,并利用相关软件对该基因编码的蛋白的理化性质、疏水性、结构域、功能及亚细胞定位等进行了生物信息学分析。【结果】毛白杨的HSP90基因序列(NCBI登录号:AGU99972.1)全长为2 100 bp,其中A+T占52.90%,C+G占47.10%,共编码699个氨基酸。毛白杨HSP90基因的生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白相对分子质量为80.08 kDa,理论等电点为4.96。毛白杨HSP90蛋白主要位于细胞核和细胞质膜中,且在N端含有1个基因保守结构域HATPase_c,可与ATP结合,具有内源ATPase活性,属于HSP90家族,为亲水性蛋白,可能具有离子通道的功能。同时,对毛白杨的HSP90基因进行系统进化分析,发现毛白杨的HSP90基因与毛果杨(gi 539331543)、大豆(gi 358248990和gi 356552478)的亲缘关系较近,而与毛果杨(gi 224124864)的亲缘关系相对较远,说明同一物种的HSP90进化可能有所不同。【结论】首次从毛白杨中成功克隆得到与抗溃疡病相关的HSP90基因,并对其序列和生物学信息进行了分析,为下一步研究HSP90基因在杨树抗溃疡病中的功能奠定基础,也为进一步研究HSP90基因在杨树抗逆胁迫中的生理功能提供了理论支持。     

荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 631 bp的Actin基因全长cDNA序列,命名为ClActin1(GenBank登录号KF366912)。序列分析表明,ClActin1开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5’非编码区90 bp,3’非编码区407 bp。预测的ClActin1蛋白分子量为41.69 kD,理论等电点为5.31,具有Actin超基因家族的保守结构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ClActin1与GenBank中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在82%以上,氨基酸序列的相似性在97%以上。与其它植物肌动蛋白比较并构建系统进化树,结果显示山茶肌动蛋白与茶树和杨树的肌动蛋白的亲缘关系最为密切。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同组织器官及不同发育时期的表达量稳定,表明ClActin1基因可作为内参基因。     

珙桐DiZF-CCCH1基因的克隆及表达分析

【目的】珙桐Davidia involucrata有性生殖能力弱是限制其自然更新的主要原因。为研究珙桐种子发育的分子机制,本课题组前期完成了珙桐种子转录组分析,筛选到1个编号为c37849.graph_c0的转录本,其在正常种子中高量表达,而在发育异常的种子中表达量很低,差异表达显著,因此将其作为研究目标。【方法】使用PCR克隆该转录本的全长序列,并利用在线分析工具对其编码氨基酸的序列特征、蛋白结构和系统进化等进行生物信息学分析预测,采用qRT-PCR检测目标基因在珙桐不同组织部位以及种子不同发育阶段中的表达情况。【结果】序列分析确定目标基因为一个编码CCCH型锌指蛋白转录因子的基因,将其命名为DiZF-CCCH1,该基因开放阅读框全长为711 bp,编码236个氨基酸,无内含子,相对分子量26.74 kDa,为不稳定蛋白,其氨基酸序列含有植物特有的RR-TZF结构域,与来源于甜橙Citrus sinensis的CCCH蛋白同源性最高。基因表达模式分析显示,DiZF-CCCH1在种子发育前期的表达量最高,后期表达量降低,在其他组织中仅有微量表达,推测其可能在种子发育过程中发挥重要作用。【结论】对珙桐DiZF-CCCH1基因进行了克隆与初步生物信息学分析,发现其编码的蛋白属于RR-TZF型锌指蛋白,且DiZF-CCCH1可能是珙桐种子发育过程中的重要调控基因,为进一步探索该基因在珙桐生殖发育过程中的功能奠定基础。     

杨树受溃疡病菌感染后转录因子的应答变化

【目的】研究杨树受溃疡病菌感染后转录因子的应答变化。【方法】提取诱导前后的毛白杨树皮mRNA，反转录生成 cDNA，构建接种溃疡病菌72 h 后的 SSH － cDNA 库，从库中获得 ESTs，将 ESTs 注释到Unisequences，挑选出与转录相关的Unisequences，利用RT－qPCR对转录基因作进一步的分析。随机挑选199个阳性克隆进行测序，测序结果经与 NCBI基因库中序列进行比较，发现172个 EST 同源序列，对这些 EST 在 dbEST 数据库进行同源检索分析。【结果】有10个序列与转录相关，占5．8%，分为4类，即：锌指蛋白，含EAR转录区域；类CONSTANS转录因子，编码核蛋白；普通转录因子，调节转录；WRKY21转录因子，参与防御信号转录。通过 RT －qPCR对其中3类(锌指蛋白、类 CONSTANS和 WRKY21)转录因子做进一步分析发现，Z锌指蛋白( Cys/His－rich)在接种溃疡病菌后，在诱导初期增长缓慢，48 h后逐渐升高，144 h达到最高，表达量是未接种时的50倍；WRKY21表达量先升高(12～24 h)，然后降低(24～96 h)，144 h 时，表达量是未接种时0.94倍；类 CONSTANS 表达量一直处于缓慢升高的趋势，直到诱导144 h，是未接种时2倍。【结论】毛白杨被溃疡病菌感染后与防御相关的转录因子表达量明显上升，这可为毛白杨抗溃疡病重要功能基因的克隆和鉴定提供理论基础。     

猴头菌MnP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆猴头菌 CB1锰过氧化物酶( MnP)基因,用于分析 He-mnp1基因及蛋白序列、基因的结构与功能,为研究猴头菌 MnPs基因功能、转录调控和构建优良工程菌株提供参考。【方法】根据 GenBank 中已报道的白腐菌MnPs基因cDNA序列的保守区域设计引物,采用简并PCR、逆转录RT-PCR、cDNA末端的快速扩增( RACE)等方法扩增出全长 cDNA基因序列,命名为 He-mnp1( GenBank 登录号为 HM116841.3),并对其猴头菌 He-mnp1基因进行生物信息学的分析。通过 NCBI 数据库进行 BLAST 同源搜索; ORF Finder 查找该基因的完整开放阅读框( ORF);利用Expasy数据库和BioEdit软件预测He-mnp1蛋白质的理化特性及氨基酸的组成;同时进行亲/疏水性及跨膜区的分析;采用 SignalP 4.1软件进行蛋白信号肽的预测;并利用 Clustal W 和 MEGA 5.1软件对 He-mnp1蛋白序列同源性比对和构建白腐菌MnPs系统发育树;利用数据库Conserved Domain Database( CDD)蛋白保守结构域的预测,查看 He-mnp1血红素、基质及锰、钙等结合位点;采用 PredictProtein 软件和 SWISS-MODEL 软件进行He-mnp1蛋白二级结构的预测和同源三维建模。【结果】该基因 He-mnp1的 cDNA 全长1279 bp,完整开放阅读框1080 bp,起始密码子 ATG,终止密码子 TAA,5'端非翻译区有68个核苷酸,3'端非翻译区有131个核苷酸,编码蛋白359 aa;生物信息学分析表明,猴头菌 He-mnp1氨基酸组成中丙氨酸含量最高,无酪氨酸,分子量为38.18 kDa,等电点为4.35,He-mnp1的蛋白有明显的亲水区,存在81－105、121－141间有2处疏水区域,此蛋白为亲水蛋白。He-mnp1蛋白质多肽前体包含1个18 aa的信号肽及1个5 aa的中间前导短肽。【结论】蛋白系统进化分析表明He-mnp1分布在第2组群,与平菇侧耳、冬生多孔菌、变色栓菌的 MnPs亲缘关系最为接近。He-mnp1基因存在1个保守结构域,分析显示为 Class Ⅱ类的真菌血红素过氧化物酶蛋白家族。He-mnp1蛋白二级结构预测α－螺旋占30.99%,β－折叠占3.38%,无规则卷曲占65.63%,属于稳定蛋白。He-mnp1蛋白三维建模,结果得到1个 Fe 血红素,2个 Ca2+、1个 Mn2+的结合位点及组氨酸残基等。     

榅桲C4H基因的克隆、序列分析及表达

【目的】肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)是调节木质素合成的关键基因,榅桲是新疆特色经济果树之一。目前,有关榅桲C4H基因的序列信息尚不明确。为了获得该基因的序列信息及其在果实不同发育时期的差异性表达规律,为深入研究该基因在榅桲果实发育过程中的作用和功能奠定基础。【方法】以榅桲果实为研究材料,基于GenBank已登录近源物种的C4H基因的cDNA序列,提取其果实的总RNA并反转录为cDNA,利用同源克隆的方法获得榅桲C4H基因的cDNA序列,并对该序列进行生物信息学分析,同时检测在榅桲果实开花后不同时间点C4H基因表达量的差异。【结果】同源克隆结果表明:C4H基因编码区的序列全长为1 518 bp,编码505个氨基酸,其蛋白的分子质量为58.28 kD。生物信息学分析结果显示:榅桲C4H蛋白为亲水性不稳定蛋白质,其二级结构以α-螺旋和无规卷曲结构为主。系统进化分析结果显示:榅桲C4H蛋白与甜樱桃(Prunus avium,XP_021806844.1)、山杏(Prunus armeniaca,VVA16404.1)的C4H蛋白同源性均较高,其相似性分别为92.87%和91.24%。实时荧光定量PCR的结果显示:随着榅桲果实的发育,在开花后10 d的果肉中C4H基因的表达量最高,随着果实的不断发育,果肉中C4H基因的表达量逐渐减少。【结论】成功获得了榅桲C4H基因全长编码区序列,并发现了C4H基因在果实发育初期的表达最高,这与榅桲果实的木质化程度密切相关。     

蜡梅花发育相关基因CpUFO表达特性与功能分析

【目的】UFO是被子植物中首个被发现的F-box蛋白,主要参与调控花分生组织特性和花器官发育。本文通过对蜡梅CpUFO基因表达特性分析及异源表达拟南芥表型分析,初步鉴定CpUFO的功能,为阐明蜡梅花发育分子调控机制提供参考。【方法】基于前期构建的蜡梅转录组数据,克隆蜡梅CpUFO基因并对其编码蛋白进行同源比对及进化树分析。根据qRT-PCR分析CpUFO基因在不同组织、器官及全年花发育各阶段中的相对表达量,比较35S::CpUFO转基因拟南芥株系及Col-0野生型表型差异,并通过qRT-PCR检测过表达拟南芥株系内源开花相关基因的表达特性,分析过表达CpUFO对拟南芥开花时间以及花器官发育的影响。【结果】获得的CpUFO基因c DNA序列为1 665 bp,编码403个氨基酸,含有保守的F-box结构域。CpUFO在外花被片中表达量相对最高,其次是内花被片,在果、茎、叶、腋芽及雌雄蕊中表达水平较低;而在全年花芽中的表达量分析结果显示,低温打破休眠后的露瓣和始花以及盛开期花芽中的表达量显著高于其他时期。与野生型拟南芥相比,35S::CpUFO转基因株系莲座叶数目减少,开花提前,且拟南芥内...     

核桃JrGA2ox基因的克隆、亚细胞定位及功能验证

【目的】GA2-oxidase(GA2ox)是赤霉素合成过程中起负调控作用的一种关键酶,能够催化有活性的赤霉素为无活性的赤霉素,从而对植物生长起到一定的抑制作用。本研究主要对核桃中赤霉素氧化酶基因JrGA2ox进行克隆及功能验证,有利于进一步探究核桃JrGA2ox基因在植物生长和发育过程中,尤其是在植物株高调控中的作用,从而助力于挖掘与利用核桃中更多的优质基因,培育出更多优良的核桃品种。【方法】采用PCR扩增技术,克隆获得核桃JrGA2ox基因的全长编码序列,进一步通过In-Fusion克隆技术构建具有强启动子的35S∷JrGA2ox∷GFP过表达载体;利用BLAST网络在线工具得到其他植物中的JrGA2ox同源氨基酸序列,并对其进行氨基酸同源序列比对和系统进化分析;其后,通过亚细胞定位揭示其发挥功能的场所,进一步利用农杆菌介导法将构建好的过表达载体转化到核桃体细胞胚中,获得JrGA2ox超表达的阳性转化植株,深入分析JrGA2ox基因的生物学特性。【结果】通过基因克隆,得到1条JrGA2ox开放阅读框,其全长为1 056 bp,共编码351个氨基酸,分子量为39.25 kDa。通过比对发现,该基因编码的蛋白序列含有保守2OG-FeII-Oxy蛋白结构域,具有GA2-氧化酶蛋白家族共同的结构特点,表明JrGA2ox属于GA2-氧化酶基因家族。氨基酸进化树比对分析结果显示,核桃JrGA2ox与毛白杨PtGA2ox聚为一个分支。且JrGA2ox蛋白与木本植物川桑MnGA2ox1、西洋梨PcGA2ox、桃PpGA2ox1及苹果MdGA2ox1蛋白序列同源性较高。烟草叶片表皮细胞亚细胞定位分析表明,JrGA2ox是定位于细胞核与细胞膜中的蛋白。对核桃体细胞胚进行基因遗传转化后经荧光检测及PCR验证表明,35S∷JrGA2ox∷GFP过表达载体被成功转入核桃体细胞胚中。阳性再生植株株高与对照苗相比具显著性差异,其平均株高为对照植株的1/2;且其株高与JrGA2ox基因表达量呈负相关。【结论】核桃JrGA2ox蛋白亚细胞定位于细胞核与细胞膜中。JrGA2ox基因调控核桃株高,主要起到负调节作用。阳性基因转化再生植株中JrGA2ox基因的表达量升高,并表现出明显的矮化特征。本研究结果可为进一步分析该基因在核桃生长发育过程中的作用提供技术参考,且为优良的矮化核桃品种选育奠定一定的基础。     

月月桂AACT基因的cDNA全长克隆及生物信息学分析

为了克隆分离月月桂AACT(乙酰辅酶A酰基转移酶)全长基因,并研究其基因特征和蛋白结构,以月月桂花瓣RNA为模板,通过反转录PCR及RACCE技术分离克隆AACT全长。再利用NCBI网站及生物信息学软件对其碱基分布、氨基酸组成、亲疏水性、二级结构、保守区及三级结构进行预测和分析,并对10个物种的AACT氨基酸进行多重比对,对基因进行进化分析。分离克隆出AACT基因的cDNA序列长为1580bp,编码405个氨基酸,该蛋白质相对分子质量为41347.89D,等电点为5.66,其中Ala含量最高为14.53%,平均疏水值为0.215,属Cond-enzymes超家族。氨基酸序列比对中,胡黄连、假马齿苋氨基酸序列同源性最高。OsAACT基因稳定,编码的蛋白为疏水性蛋白,其在进化过程中相对保守。试验获得的基因信息为萜类物质合成途径进一步研究奠定基础。     

巨桉低温胁迫响应基因EgrCR的表达与功能

【目的】通过对巨桉中冷响应基因EgrCR(Eucgr.B02857)的蛋白序列特征、亚细胞定位、低温等非生物逆境条件下的表达以及拟南芥中该基因超表达株系的表型分析,探讨EgrCR基因在巨桉响应低温等非生物逆境中的作用。【方法】利用Protparam,PSIPRED,TMHMM,Mat Inspector和MEGA等生物信息学软件,预测EgrCR编码蛋白结构特征、启动子上的重要顺式作用元件,并构建其同源蛋白序列进化树;同时,采用基因枪轰击洋葱表皮方法进行基因编码蛋白亚细胞定位分析;组织特异性表达及低温等非生物逆境及昼夜节律下的表达分析,分别采用半定量和定量RT-PCR方法。通过构建35S::EgrCR超表达载体转化拟南芥,观察转基因株系在不同低温(0,4℃)处理下的表现,研究该基因对低温响应的功能特性。【结果】EgrCR编码的蛋白序列含有144个氨基酸,二级结构中包含4个α螺旋、3个β折叠,没有预测到结构域、跨膜域的存在。在进化的亲缘关系上,EgrCR与毛果杨中的同源蛋白亲缘关系最近,氨基酸序列相似度达到68%。在其启动子序列上含有多个与植物逆境响应相关的顺式作用元件。亚细胞定位结果表明其编码蛋白在核中表达。正常条件下,EgrCR主要在茎和叶中表达。不同低温(0,2,4,6,8℃)处理和4℃低温下随处理时间(2,6,12,24,48 h)的延长,EgrCR受到强烈的诱导。ABA(100μmol·L~(-1))对EgrCR表达没有明显影响,而NaCl(200 mmol·L~(-1))处理下则表现为先抑制后促进。昼夜节律也影响EgrCR的表达,光照下基因表达被诱导,黑暗条件下基因表达受抑制。拟南芥中EgrCR超表达转基因株系4℃处理条件下,花青素苷积累现象减轻;0℃处理3天再恢复生长1周后,超表达株系能快速恢复生长,表现出较强的耐低温能力。【结论】EgrCR基因参与巨桉低温胁迫响应,还可能参与巨桉的高盐胁迫响应,昼夜节律对其表达也有影响。     

桃水孔蛋白基因克隆及序列分析

为给水孔蛋白(AQP)在低温对花芽发育和休眠调控中的作用研究奠定基础,以低温休眠的桃"满天红"花芽为试材,提取总RNA,根据其它植物AQP基因保守区设计简并引物,采用RT-PCR方法,扩增出3个编码长约147个氨基酸序列的水孔蛋白基因PpPIP1-1、PpPIP1-2和PpPIP2-1。同源性比对结果表明这些序列与其它物种AQP基因具有较高的同源性。这3个AQP基因的氨基酸序列均具有MIP家族的特征信号序列SGXHXNPAVT,还具有植物质膜水孔蛋白(PIP)家族的特征信号序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN。经系统发育分析将这3个AQP基因分为2类,分属PIP蛋白的PIP1和PIP2亚家族成员。     

粗毛纤孔菌糖苷水解酶5基因克隆及蛋白质结构分析

【目的】克隆得到粗毛纤孔菌糖苷水解酶5基因,并对该基因进行生物信息学分析、蛋白质原核表达和酶活研究,为糖苷水解酶的利用提供依据。【方法】分离纯化粗毛纤孔菌,并于PDA斜面长期保存。应用TRIzol提取粗毛纤孔菌总RNA,通过AMV反转录系统将RNA反转录成c DNA,构建c DNA文库;应用NCBI BLAST分析并检测糖苷水解酶基因家族5阳性序列,RACE法克隆基因全长命名为Ih GH5-1并提交NCBI注册;ORF-Finder分析Ih GH5-1基因开放阅读框,推导出氨基酸序列;筛选NCBI登录的糖苷水解酶家族5同源序列,Clustal W进行保守结构域区段多序列比对;应用Mega 5.05选用WAG+G模型构建最大似然树;应用PSIPRED server对Ih GH5-1进行α螺旋和β折叠的蛋白质二级结构分析,应用SWISS-MODEL对Ih GH5-1进行三维建模,应用VMD1.8.6分析Ih GH5-1三维结构;设计原核表达引物并进行PCR扩增,将扩增得到的基因片段连接至p QE-30 UA载体并转入大肠埃希菌JM109感受态细胞,诱导表达后通过SDS-PAGE电泳检测表达量;测定糖苷水解酶活性并计算酶活。【结果】TRIzol提取的粗毛纤孔菌总RNA经分光光度计检验符合标准(OD260/OD280=2.0,OD260/OD230>1.8),c DNA文库成功构建并测序;RACE法克隆得到5’序列长度为770 bp,3’序列长度为1 562 bp且含有Poly A的序列,5’和3’序列拼接得到基因全长序列长1 727 bp,NCBI注册号为KM368321;ORF分析得到Ih GH5-1氨基酸序列含有300个氨基酸,分子质量为31.226 55 k D,等电点(p I)为9.24;结构域分析表明Ih GH5-1具有保守的催化结构域;最大似然树分析表明多数子囊菌糖苷水解酶家族5聚在一起,多数担子菌糖苷水解酶家族5聚在一起,粗毛纤孔菌Ih GH5-1蛋白质与太瑞斯梭孢壳霉和球毛壳菌等子囊菌的糖苷水解酶亲缘关系更近;蛋白质三维结构分析表明粗毛纤孔菌Ih GH5-1含有7个α螺旋、4个β折叠,三维比对表明粗毛纤孔菌Ih GH5-1三维结构与其他真菌糖苷水解酶家族5蛋白空间结构相近,进化关系与最大似然树分析相符;原核表达及酶活测定表明该基因成功表达,表达产物在65℃时相对酶活性最高。【结论】本研究可为白腐菌纤维素酶大规模的工业化应用提供前期研究基础和理论依据。     

4种植物病害植原体病原质粒全序列测定及分子特征

根据已发表植原体质粒序列设计引物,经2次PCR扩增,获得大小不同的2段DNA片段,测序后拼接得到4种完整的环状质粒,分别是桑树萎缩植原体濮阳株系质粒(pMDPy)、长春花绿变植原体海南株系质粒(pPeVHn)、泡桐丛枝植原体山东株系质粒(pPaWBG33D)及苦楝丛枝植原体福清株系质粒(pCWBFq-2),其中pMDPy为首次测定,其质粒全长分别为3 833,3 943,3 843和3 913 bp,4种质粒皆编码5种蛋白,ORF1和ORF5分别编码复制相关蛋白(RepA)和单链DNA结合蛋白(SSB),ORF2-4编码未知功能蛋白.4种质粒序列的非编码区分析表明,ORF1和ORF2之间的非编码区存在启动子和核糖体结合位点.将4种植原体质粒全序列与GenBank中登录的植原体质粒进行序列相似性比对和系统进化分析,结果表明这4种质粒与其他16Sr Ⅰ组的质粒聚为一个大的分支,与16S rDNA系统发育树基本一致.这可为进一步深入了解不同植原体质粒的结构与功能、寄主专化性和质粒基因变异及进化奠定基础,也可为基于多基因分类鉴定提供新的理论依据.     

蜡梅转录因子CpTAF10基因的克隆及功能分析

【目的】 TATA框结合蛋白相关因子TAF10作为基本转录因子之一,在生长发育和胁迫响应过程中发挥着广泛的、重要的生物学作用。对蜡梅中TAF10同源基因 CpTAF10的克隆与功能分析,有利于丰富对植物TAFs基因功能的认识,并为解析蜡梅抗逆形成的转录调节机理提供新的理论依据。【方法】以转录组数据库中获得的蜡梅TAFs家族基因序列,克隆得到 CpTAF10基因的cDNA序列,并对其编码蛋白进行序列特征和进化树分析。采用实时荧光定量PCR 技术分析 CpTAF10基因在蜡梅不同组织及花期中的表达特性,以及高温、低温、盐胁迫及ABA处理后的表达变化。同时,构建 CpTAF10基因的过表达载体,采用花序侵染法进行拟南芥遗传转化,对拟南芥转基因纯合株系进行表型观察和胁迫耐性分析。【结果】获得的 CpTAF10基因 cDNA序列为712 bp,包含405 bp的开放阅读框(ORF),编码134个氨基酸,蛋白理论分子量为15.21 kDa,预测的等电点pI值为5.19。CpTAF10蛋白序列与其他植物同源序列具有较高的同源性,蛋白多序列比对显示CpTAF10蛋白属于TAF10同源蛋白,并含有组蛋白折叠结构域。表达特性分析结果发现,CpTAF10基因在蜡梅的根、茎、子叶、幼叶、成熟叶和花6个不同组织中均有不同程度的表达,其中,在成熟叶中的表达量最高。 CpTAF10在蜡梅花朵的不同花期中,呈现出波动的表达模式,在衰老期表达量最高。在低温、盐胁迫和ABA处理的蜡梅叶片中均能被诱导表达,但其表达变化各不相同。在拟南芥中过表达 CpTAF10基因可提高盐胁迫下拟南芥种子的萌发率,相对于野生型植株,转基因植株的主根和侧根在盐胁迫下均表现出一定的生长优势。【结论】 CpTAF10基因能在低温、盐胁迫和ABA处理后诱导表达,可能参与蜡梅逆境胁迫耐性的分子调控。在拟南芥中过表达 CpTAF10基因显著提高了转基因拟南芥的萌芽率及主根和侧根的生长优势,在一定程度上可增强植物的盐胁迫耐性。     

松材线虫热激转录因子Bx-HSF-1基因的克隆及表达分析

【目的】通过对热激转录因子基因Bx-HSF-1的克隆和表达分析,为深入研究c GMP、TGFβ-like和Insulin/IGF等热激抗逆代谢路径提供理论基础。【方法】根据松材线虫基因组数据设计引物克隆松材线虫Bx-HSF-1基因。进一步对Bx-HSF-1进行Gene Ontology基因功能预测、系统发育分析、保守结构域分析等生物信息学分析。应用JASPAR预测Bx-HSF-1靶位点DNA序列,根据松材线虫基因组数据筛选含有该序列的靶基因,并通过蛋白质三维结构分析和分子对接验证。应用荧光定量q-PCR检测Bx-HSF-1及其靶基因在热激和低温处理条件下4个时间点的表达量,结合转录组数据对Bx-HSF-1及其靶基因的表达量相关性进行分析。采用原位杂交对Bx-HSF-1基因在松材线虫体内的表达部位进行了分析。【结果】根据基因组数据,克隆到松材线虫热激转录因子Bx-HSF-1基因长度为1 404 bp的涵盖完整蛋白编码区基因序列。结构域分析表明Bx-HSF-1基因编码蛋白质的氨基酸序列含有DNA结合结构域和亮氨酸拉链结构域。GO分析表明该基因参与延长线虫寿命、正向调控繁殖率、运动、热激反应、抗逆态幼虫发育和抗逆反应等生理过程,并具有特异DNA序列结合的分子功能。氨基酸疏水性分析表明该DNA结合结构域由3个α螺旋和4个反向平行的β折叠构成一个疏水核心,该疏水核心可以与热激元件靶位点互作。对松材线虫基因组进行BLAST比对筛选出Bx-DAF-7是Bx-HSF-1的靶基因,Bx-DAF-7基因TATA盒上游序列具有Bx-HSF-1靶位点序列。荧光定量q-PCR结果表明热激和低温处理同样促进Bx-HSF-1转录、抑制Bx-DAF-7转录,Bx-HSF-1与Bx-DAF-7的表达量负相关。原位杂交结果表明Bx-HSF-1基因在正常培养线虫体内各细胞均有微量表达,热激培养线虫前体部信号显著,峡部和肠区体壁信号较显著。【结论】本研究表明Bx-HSF-1具有特异DNA序列结合的分子功能。预测抗逆态幼虫形成基因Bx-DAF-7是Bx-HSF-1靶基因。转录组测序及q-PCR结果表明Bx-HSF-1与Bx-DAF-7的表达量负相关。Bx-HSF-1基因受温度刺激后多数体细胞内均有较高表达,特别是神经元、体壁肌肉细胞和皮下细胞中表达显著。     

桉树PAL基因克隆及焦枯病菌诱导下的表达分析

[目的]克隆桉树苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及在焦枯病菌诱导下的表达特征,为探究桉树抗焦枯病机理提供理论支撑。[方法]通过SOE-PCR技术从尾细桉M1中克隆PAL基因,利用real-time PCR分析其在焦枯病菌诱导下的表达特性。[结果]克隆得到尾细桉M1 PAL基因,其ORF序列长2 142 bp,编码713个氨基酸,与其他已发表的桉树PAL相似性均在99%以上。序列分析发现,其编码蛋白是一类稳定的亲水性蛋白,含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3个磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,具有典型的苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构域。进一步分析桉树不同品系PAL基因的表达趋势,结果发现,不同品系PAL基因在焦枯病菌诱导下均表现为明显的上调表达,且抗性越强,PAL基因越早上调,上调表达量越大。[结论]从尾细桉M1中克隆得到的PAL基因具有典型的PAL家族成员特征,推测该基因可能通过参与酚类防御性物质或者信号分子SA等物质的合成,进而在桉树抵抗焦枯病菌侵染的过程中发挥重要作用。     

杨树腐烂病菌胞外分泌复合体亚基CcExo70的功能

【目的】对杨树腐烂病菌金黄壳囊孢胞外分泌复合体亚基CcExo70进行功能分析,探究其在杨树腐烂病菌生长发育及致病过程中的生物学功能,为深入了解杨树腐烂病菌致病机制以及制定病害防控策略提供科学依据。【方法】1)利用PCR技术克隆得到CcExo70基因的DNA序列; 2)通过生物信息软件对其编码的氨基酸序列进行特征分析并构建其同源基因的系统发育树; 3)通过PEG介导的遗传转化法得到CcExo70基因的敲除突变体及回补菌株; 4)通过PDA平板生长试验和PDB摇培试验,分析敲除CcExo70基因对该病菌生长发育、菌丝形态及H2O2胁迫响应的影响;通过对1年生欧美杨健康枝条烫伤接种的方法,测定CcExo70基因对该病菌致病性的影响; 5)利用荧光增白剂(CFW)、二氨基联苯胺(DAB)和FM4-64染剂探究各菌株中几丁质沉积、活性氧积累及内吞作用情况; 6)通过蛋白质组测序分析,筛选可能受CcExo70调控分泌的外泌蛋白。【结果】1)在杨树腐烂病菌中克隆得到了一个CcExo70基因,该基因全长1 992 bp,包含1个内含子,编码636个氨基酸。2)系统发育和序列比对分析表明,CcExo70与其他病原真菌的同源基因在进化上是高度保守的。3)利用遗传转化法筛选得到2个敲除突变体(ΔCcExo70-8、ΔCcExo70-9),并获得了回补菌株(ΔCcExo70/C)。4)表型分析发现,与野生型和回补菌株相比,CcExo70敲除突变体在菌丝生长、形态发生、氧化应激反应和致病力等方面存在显著的缺陷。5) CFW染色观察显示,野生型和回补菌株菌丝尖端存在明显的几丁质沉积,而敲除突变体菌丝尖端未见明显的几丁质沉积但菌丝隔膜异常增加。此外,共聚焦显微镜观察发现,与野生型和回补菌株相比,CcExo70敲除突变体的内吞作用显著延迟。6)蛋白组测序分析发现,8个候选的外泌蛋白在CcExo70敲除突变体胞外培养滤液中的含量显著低于在野生型胞外培养滤液中的含量(降低了50%以上),其中有4个候选的外泌蛋白(CcSP2、CcSP3、CcSP6、CcSP7)在胞外培养滤液中的含量显著高于其对应菌株的胞内含量,其中包括1个候选的效应分子(CcSP2)和2个糖苷水解酶(CcSP6和CcSP7),表明这4个外泌蛋白的分泌受到了CcExo70的调控。【结论】胞外分泌复合体亚基CcExo70在杨树腐烂病菌的生长、胁迫响应、内吞作用和致病性等方面起着重要的调控作用。