外源添加乙偶姻对酿酒酵母W5/W141产2,3-丁二醇的影响

本研究旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。向酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W5/W141两株产2,3-BD菌株中添加不同浓度乙偶姻,并测定2,3-BD、乙醇和甘油产量随发酵时间的变化情况。S. cerevisiae W5最适乙偶姻添加浓度为12 g/L,且2,3-BD的产量在72 h达到最大,产量为2.54±0.03 g/L,甘油和乙醇转化率分别较未添加时下降了17.6%和23.6%。S. cerevisiae W141最适乙偶姻添加浓度为10 g/L,且2,3-BD的产量在72 h达到最大,产量为1.71±0.02 g/L,甘油和乙醇转化率分别较未添加时下降了57.1%和16.7%。通过对比,本课题最终选用S. cerevisiae W5作为最适菌株,为微生物发酵法生产2,3-BD提供新的资源。     

CRISPR/Cas9技术敲除酿酒酵母gpd2基因对产2,3-丁二醇的影响

旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除酿酒酵母甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2),探究其对2,3-丁二醇产量的影响。根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2)设计供体片段及gRNA片段,将gRNA片段与可表达Cas9蛋白的敲除载体相连,之后将重组质粒及供体DNA片段转化到S. cerevisiae W5细胞中,根据表型筛选及PCR验证获得gpd2基因缺失菌株。结果表明目的基因gpd2敲除成功,基因缺失菌株与原始菌株经发酵实验相比,甘油产量下降22.01%,乙醇产量提高24.65%,2,3-丁二醇产量下降10.60%。gpd2基因的敲除并没有提高2,3-丁二醇的产量,原因可能是逐渐积累的NADH会优先被细胞内大量的乙醇脱氢酶所氧化,作用于乙醇的产生,而不是优先作用于2,3-丁二醇的合成。本实验构建了适用于酿酒酵母的基因敲除系统,该系统对进一步探究酿酒酵母其他代谢产物与2,3-丁二醇合成之间的关系具有实际的借鉴意义。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3菌株发酵特性研究

通过对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3进行菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。本研究采用摇瓶发酵法,改变发酵过程中的底物浓度、溶氧量和酸碱浓度,紫外分光光度法和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测2,3-BD合成途径中关键中间产物(丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻)含量和发酵产物浓度。结果表明:S. cerevisiae WBG3菌株生长良好,在80 g/L葡萄糖、30℃和200 r/min条件下,丙酮酸、α-乙酰乳酸和乙偶姻含量分别达到0.10±0.03 g/L、3.38±0.06 g/L和0.17±0.02 g/L,乙醇转化率最低为0.44±0.02 g/g。添加乙酸后,甘油产量和乙醇转化率分别较对照组降低了9.5%和10%,2,3-BD的最终产量为0.36±0.02 g/L。因此,S. cerevisiae WBG3具备生产2,3-BD的潜力。     

高产2,3-丁二醇的潜在酿酒酵母菌株筛选

为了获得潜在高产2,3-丁二醇的酿酒酵母菌株,探究不同菌株生产2,3-丁二醇的潜力。通过对不同供试菌株进行形态观察、产物耐受性检测、关键酶活测定、乙偶姻产量以及发酵试验,筛选出一株生产2,3-丁二醇最有潜力的菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W141。结果表明,发现W141菌株生长迅速,能分别耐受13%(w/v)乙醇和0.8%(w/v)乙酸,具有较高的乙醇得率(0.593 g/g)和碳源利用率（发酵24 h葡萄糖消耗率为100%）,关键酶α-ALS、BDH的酶活力较高,分别是0.046 U/mg和0.040 U/mg,2,3-丁二醇途径关键中间产物乙偶姻含量较高,可达0.246 g/L。说明该菌株在发酵工业中具有一定的改造空间和应用前景。     

2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株的构建和初步鉴定

旨在过表达BudC进而上调2,3-丁二醇（2,3-Butanediol, 2,3-BD）的合成,通过基因工程手段构建整合载体pR1SW-BudC,经PCR和酶切双重验证后将其电转化至产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HD79。结果经卡那霉素筛选,获得一株菌株K. oxytoca HD79-01。以原始菌株为对照,摇瓶发酵检测2,3-BD含量和相关酶活,q RT-PCR检测BudC表达差异,最终BudC在HD79-01中转录水平的表达量为HD79的45.25倍（p<0.01）。摇瓶发酵显示2,3-BD的最高产量、转化率和生产强度分别提高了24.54%、10.97%、45.08%（分别为30.818 ± 0.003 g/L、0.253 ± 0.013 g/g、0.43 ± 0.01 g/(L·h)）,酶活提高了3.61倍(0.563 ± 0.003 U/mg)。因此,2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株构建不仅成功的提高了2,3-BD的产量也为实现2,3-BD的工业化生产奠定基础。     

外源添加乙偶姻对酿酒酵母产2,3-丁二醇及其菌株的影响

通过对菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株.本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5/W5-△pdc1/W5-△pdc5/W141四株菌株为试材,利用高效液相色谱法(HPLC)对乙偶姻产量和BDH酶活进行检测,从而挑选出最适合作为产2,3-BD...     

ptsG基因敲除对肺炎克雷伯氏菌CCR效应的缓解及发酵产2,3-BD的影响

旨在解决Klebsiella pneumoniae在利用混合碳源发酵生产2,3-丁二醇（2,3-butanediol,简称2,3-BD）时会产生碳分解代谢抑制(Carbon catabolite repression,CCR)效应,导致生产效率下降的问题。本研究以Cm抗性基因为标记,采用λRed同源重组技术成功构建ptsG基因缺失菌株K. pneumoniae HD79-N。此外,在利用葡萄糖与木糖混合碳源（葡萄糖:木糖=2:1）发酵的结果显示,K. pneumoniae HD79-N菌株由于敲除ptsG基因显著减弱了CCR效应,使其能够同步利用葡萄糖与木糖生产2,3-BD且最终产量达9.81±0.38 g/L。同时,K. pneumoniae HD79-N[0.23±0.01 g/(L·h)]菌株木糖利用率也比K. pneumoniae HD79[0.15±0.00 g/(L·h)]菌株提高了57.82%。本研究结果为缓解ptsG基因对K. pneumoniae菌株的CCR作用及提升2,3-BD的产量提供技术参考。     

微生物转化生产木糖醇工艺研究

从土壤中筛选获得了1株木糖醇高产菌株,该菌株发酵玉米芯水解液后获得的发酵液,通过离心去除菌体,用紫外分光光度法测得木糖醇产量。采用摇瓶发酵对发酵工艺条件进行优化,通过测定发酵液中木糖的残留量、木糖醇的产量、木糖醇的转化率来确定最佳的发酵工艺。结果表明,木糖醇的产量由最初3.12g/L增加到8.79g/L,转化率由15.6%增加到43.95%;优化后,最佳培养基条件为:选用木糖质量浓度为20g/L的玉米芯水解液为碳源,质量浓度为2.5g/L的蛋白胨和2.5g/L的酵母浸膏作为氮源,质量浓度为3.0g/L的KH2PO4,4.0g/L的NaCl,0.5g/L的MgSO4·7H2O,最佳发酵条件为:摇瓶发酵装液量80mL/250mL,转速160r/min,pH值为5.0,发酵温度30℃,发酵时间44h,在此条件下,木糖醇最大产量是13.84g/L,木糖转化率达69.0%。该菌株经初步研究,显示了良好的研究潜力和应用前景。     

阴沟肠杆菌乳酸脱氢酶基因缺失突变株的构建及其生物学特性

旨在应用自杀质粒重组技术,构建阴沟肠杆菌乳酸脱氢酶突变株,为进一步提高乙偶姻的产量和扩大菌株选择范围奠定基础。利用双酶切的方法将同源片段插入到自杀质粒pKR6K中,构建出ldh基因敲除质粒,然后利用细菌接合的方法敲除E. cloacae的ldh基因。成功克隆出两段E. cloacae乳酸脱氢酶基因的同源序列,长度分别为526 bp,通过序列比对分析,E. cloacae乳酸脱氢酶基因序列相似性为100%。通过对E. cloacae进行乳酸脱氢酶基因的敲除,成功构建一株ldh缺失重组菌株E. cloacae△ldh,同时2,3-丁二醇提高6.8%,乙酸提高了24.3%。E. cloacae乳酸脱氢酶缺失工程菌株构建成功,对利用微生物法工业化生产乙偶姻奠定基础。     

乙酰乳酸合成酶基因(budB)整合表达载体的构建

为了进一步了解2,3-丁二醇合成路径中关键酶的表达量与产量之间的关系,本研究根据Gen Bank中乙酰乳酸合成酶基因(bud B)的基因序列设计引物,以产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HD79基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到目标酶基因,目的片段全长1680 bp。以表达载体p RSFDuet-1为骨架,利用基因工程手段构建整合表达载体p R1SW-bud B。电转化法将其转化至菌株HD79感受态细胞中,通过高浓度Kan筛选和PCR双重鉴定验证后测定ALS酶活力。结果表明,乙酰乳酸合成酶基因整合表达载体构建成功,酶活可达1.0627 U/mg,比原始菌株提高了4.35倍。在一定程度上为实现2,3-丁二醇的工业化生产奠定基础。     

编码酿酒酵母丙酮酸脱羧酶(Pdc6)基因克隆及其生物信息学分析

旨在从生物信息学角度更好地研究酿酒酵母丙酮酸脱羧酶(Pdc6)的结构和功能,克隆酿酒酵母H5的丙酮酸脱羧酶基因pdc6。利用Primer 5.0软件设计1对20 bp引物,以H5基因组DNA为模板克隆获得pdc6,并利用生物信息学分析方法对其序列进行验证及分析。该序列长度为1692 bp,无碱基缺失,且该基因具有完整的开放阅读框,该基因编码的Pdc6包含563个氨基酸残基,该蛋白质中酸性氨基酸残基数量和碱性氨基酸残基数量大致相同;Pdc6理论等电点5.8,疏水性最大值为2.32,亚细胞定位预测其位于细胞外基质,属于酸性蛋白质,并预测了空间结构模型。本研究说明该蛋白结构与Pdc1和Pdc5结构类似,对酿酒酵母H5编码丙酮酸脱羧酶(Pdc6)基因序列克隆和生物信息学分析后,可为后续单基因敲除选取基因顺序的研究提供一定的理论基础。     

纤维素酶对甜高梁秸秆发酵产酒率影响的研究

采用固态发酵法,进行了生产燃料乙醇的试验,同时尽量在相同条件下,研究了纤维素酶对甜高粱秸秆发酵产酒率的影响.实验分2组,第1组为空白试验:酵母菌接种量为0.2%,发酵温度28℃.第2组为对照试验:酵母菌接种量为0.2%,发酵温度28℃,纤维素酶0.8%,发酵时间为114 h.结果表明,第1组折算,甜高粱茎秆发酵产酒,体积分数为61%的乙醇得率为3.5 g/100 g;第2组折算,体积分数为61%的乙醇得率为6.56g/100g,比不加纤维素酶的乙醇得率提高了3.06%.     

纤维素酶对甜高粱秸秆发酵产酒率影响的研究

采用固态发酵法,进行了生产燃料乙醇的试验,同时尽量在相同条件下,研究了纤维素酶对甜高粱秸秆发酵产酒率的影响。实验分2组,第1组为空白试验:酵母菌接种量为0.2%,发酵温度28℃。第2组为对照试验:酵母菌接种量为0.2%,发酵温度28℃,纤维素酶0.8%,发酵时间为114h。结果表明,第1组折算,甜高粱茎秆发酵产酒,体积分数为61%的乙醇得率为3.5g/100g;第2组折算,体积分数为61%的乙醇得率为6.56g/100g,比不加纤维素酶的乙醇得率提高了3.06%。     

草地贪夜蛾寄主选择性及对其生长发育的影响

旨在为草地贪夜蛾的预测预报、科学防控、适生性分析以及风险评估提供参考依据。以盆栽香蕉苗、玉米苗和草地贪夜蛾3~4龄幼虫作为试材,用室内接虫和田间自然感虫的方法,测定了选择压力和非选择压力条件下草地贪夜蛾对香蕉和玉米的危害指数、草地贪夜蛾发育历期、幼虫存活率、蛹体大小及成虫羽化率。在非选择压力条件下草地贪夜蛾主要选择危害玉米,对香蕉‘桂蕉6号’只是试探取食,接虫7天后对玉米和香蕉危害指数分别是89.05、1.58。在选择压力下草地贪夜蛾幼虫接虫3天后开始取食危害香蕉,接虫后3、5、7天危害指数分别为11.74、16.51、24.76,说明香蕉不是草地贪夜蛾适宜的寄主作物。取食香蕉的草地贪夜蛾幼虫生长缓慢、虫体小,3龄幼虫至化蛹历时9~14天,比取食玉米的草地贪夜蛾长2~4天;成虫羽化历时9~14天,比取食玉米的草地贪夜蛾长4~7天;取食香蕉明显影响草地贪夜蛾生长发育,幼虫存活率为20.0%、化蛹率68.1%、蛹体大小1.25×0.35 cm、蛹重0.13 g、成虫羽化率47.8%,明显低于取食玉米寄主的幼虫存活率为86.7%、化蛹率97.4%、蛹体大小1.57×0.5 cm、蛹重0.21 g、成虫羽化率92.0%。草地贪夜蛾在选择压力下会取食危害香蕉,危害程度相对较轻,能完成世代生活史,但生长发育速度也较慢。香蕉不是草地贪夜蛾适宜的寄主植物,但在香蕉上暴发存在一定的风险。