烟草肌醇半乳糖苷合成酶基因NtGolS1的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS,以辣椒GolS基因为探针,通过电子克隆法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码GolS基因的cDNA序列,暂被命名为NtGolS1.NtGolS1包含一个完整的开放读码框,编码343个氨基酸,具备糖基转移酶保守结构域;序列比对结果表明,NtGolS1蛋白与其他植物的GolS蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,NtGolS1与耐旱植物维柯萨的Gols亲缘关系最近.这些结果为进一步研究NtGolS1的性质和功能,并为植物抗逆基因工程研究提供理论基础     

大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS克隆及非生物胁迫表达分析

【目的】本文探索了大豆肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)基因与非生物胁迫的关系。【方法】通过RT-PCR从大豆叶片cDNA中扩增编码GolS的基因GmGolS。生物信息学分析预测该基因及编码蛋白的理化性质。构建系统进化树分析GolS蛋白的亲缘进化关系。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在非生物胁迫下的表达模式。【结果】GmGolS基因ORF全长987 bp,编码328个氨基酸,分子量38.03 kDa,等电点5.79。GmGolS蛋白定位于细胞的叶绿体和/或细胞质中,并且与沙冬青AmGolS蛋白的亲缘关系最近。干旱、高盐和低温胁迫均可不同程度的诱导GmGolS基因的表达,且GmGolS对干旱胁迫的响应最为明显。【结论】以上结果表明GmGolS基因在大豆中可响应多种非生物胁迫,为GmGolS在大豆抗逆基因工程育种中的进一步应用提供理论依据。     

黄瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS2克隆与表达调控

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是合成棉子糖系列寡糖(RFOs)的关键酶,在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥重要作用。为探究GolS2基因在黄瓜应答非生物胁迫中的作用,本研究采用RT-PCR法从黄瓜中克隆了GolS2基因,其开放阅读框长度为981 bp,编码326个氨基酸,植物GolS2蛋白氨基酸序列一致性很高。进化树中,黄瓜GolS2蛋白与拟南芥GolS2和GolS3蛋白聚在同一分支,亲缘关系最近。盐胁迫和低温胁迫处理显著诱导GolS2基因在黄瓜幼苗中的表达,但低温处理显著抑制GolS2基因在采后黄瓜果实中的表达。对其启动子顺式作用元件的分析结果显示,GolS2基因启动子中含有多个与逆境胁迫响应有关的顺式作用元件。在采后黄瓜果实中沉默HHO2和GRP3基因的表达,显著下调GolS2基因表达,表明这两个基因调控GolS2基因表达。本研究结果明确了GolS2基因在不同类型黄瓜组织中应答非生物胁迫的功能存在差异,这为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS及非生物胁迫表达分析

[目的]本文探索了大豆肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)基因与非生物胁迫的关系.[方法]通过RT-PCR从大豆叶片cDNA中扩增编码GolS的基因GmGolS.生物信息学分析预测该基因及编码蛋白的理化性质.构建系统进化树分析GolS蛋白的亲缘进化关系.采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在非生物胁迫下的表达模式.[结果]G...     

刺齿报春苣苔肌醇半乳糖苷合成酶基因的鉴定及序列分析

肌醇半乳糖苷合成酶基因与植物光合产物运输、种子耐脱水性、抵御生物与非生物胁迫和自我保护等生理生化过程密切相关。基于刺齿报春苣苔(Primulina spinulosa)转录组测序数据,获得(鉴定)1个肌醇半乳糖苷合成酶基因。序列分析结果表明,该基因全长1 347 bp(GenBank登录号为MG521418),开放阅读框(ORF)为1 008 bp,共编码335个氨基酸。进一步基于氨基酸序列的分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为38.05 ku,理论等电点为5.09,为亲水性蛋白,含有1个与糖基转移酶家族蛋白相同的保守结构域;刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因与同科的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica,FJ222452)的相似性高达90%,两者在系统进化树上聚为1支。研究结果为进一步研究刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的分子结构和功能奠定了基础。     

拟南芥中低温诱导肌醇半乳糖苷合成酶基因表达作用初探

研究了拟南芥中肌醇半乳糖苷合成酶基因(AtGol-3)在低温条件下表达量的变化。结果表明,AtGol-3基因受到低温胁迫诱导;并且AtGol-3基因在低温诱导晚期大量表达,这与其上游受到低温诱导相关的DREB/CBF和ABRE等转录因子的调控有关。     

水稻乙酰乳酸合成酶基因的克隆和功能分析

乙酰乳酸合成酶（ALS）是植物和微生物中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸合成途径的一个关键酶，该基因在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值。利用生物信息学分析，自水稻中分离了ALS基因的cDNA和基因组DNA序列。序列分析表明，ALS基因没有内含子，GC碱基含量高并不对称分布。软件预测ALS基因是单拷贝基因位于第4号染色体上，Southern杂交验证了此结果。构建A岱基因的植物表达载体并转化烟草，转基因烟草通过PCR-Southern验证。EXACT-RT-PCR结果表明，水稻ALS基因在转基因烟草的叶片和根部均有转录发生。利用甲嘧磺隆进行除草剂抗性测试，和对照烟草相比转基因烟草除草剂抗性高达50mg·L^-1。     

棉花烟酰胺合成酶基因GbNocotin及其启动子的克隆和功能分析

【目的】克隆棉花烟酰胺合成酶基因及其启动子,明确其表达特征,分析其在转基因育种中的应用前景。【方法】根据对一个棉花Maxxa BAC克隆（78L16）的测序结果,首先从海岛棉品种海7124中PCR扩增获得了棉花烟酰胺合成酶基因GbNocotin的启动子序列,并利用网上数据库PLACE对该序列进行调控元件的预测分析。其次构建该启动子与GUS 连接的重组载体pGbNocotin::GUS,并通过花浸染法转化拟南芥并获得转基因植株,分别在幼苗期和成熟期对转基因植株进行GUS染色分析。然后通过RT-PCR获得GbNocotin的开放阅读框（ORF）序列,并利用Mega5.0对GbNocotin进行进化树分析,最后利用实时荧光定量PCR（Real Time PCR）对该基因进行组织表达,诱导表达分析。【结果】GbNocotin的启动子区为1.8 kb,通过相似性比较预测发现该启动子含有1个专一性Fe缺乏诱导元件IRO2OS,还含有干旱、重金属、病原物等逆境响应元件以及植物激素响应元件等。对转化pGbNocotin::GUS拟南芥植株的GUS染色结果表明,在幼苗期GUS基因主要在根部以及下胚轴处表达,而在成熟期除了在根部表达外,还在果荚的基部、花序以及叶柄基部表达。GbNocotin的开放阅读框含有864个核苷酸,编码287个氨基酸,该蛋白等电点为6.76,分子量为 32.7 kD。虽然在第11-286位氨基酸处具有NAS保守结构域（PFAM accession number: PF03059）,但是与其他植物来源的该类基因相似性较低,与相似度最高的拟南芥的ATNAS3也仅有43%的相似性。GbNocotin的表达具有器官差异性,在根和茎中的表达最强,其次是棉纤维和花,但是在叶片及胚珠中表达量很低。另外,该基因在缺铁条件下表达量显著上升,在缺铁处理一周后棉花幼根中的表达量较对照增加9倍。而CuSO4、PEG、脱落酸（ABA）以及赤霉素（GA）处理均抑制其表达,但是抑制程度不同。尽管4种条件处理24 h后都会使GbNocotin的表达量显著降低,但是CuSO4和ABA的抑制效果最为显著。而48 h后,PEG和GA处理基因的表达量得到恢复,但是CuSO4和ABA处理表达量仍然较低。【结论】GbNocotin的表达具有器官差异性,并受铁缺失诱导以及胁迫条件抑制。该基因与棉花Fe的吸收可能密切相关,有潜在的应用价值。     

大青杨纤维素合成酶PuCesA6基因cDNA的克隆及序列分析

以大青杨总RNA为模板,通过反转录PCR获得纤维素合成酶PuCesA6基因的全长cDNA序列。序列分析结果表明：其cDNA序列全长3778bp,开放读码框序列3264bp,共编码1087个氨基酸。PuCesA6基因编码的氨基酸序列具备被子植物纤维素合酶基因的特征：锌指结构域、高变区I（HVR—I）、高变区II（HVR—II）与β-糖苷转移酶有关的保守结构域以及8个跨膜区。通过多氨基酸序列比对发现,与光皮桦B1CesA5相似度最高,为89％;其次是玉米ZmCesA8,相似度为80％,且8类CesA的锌指结构与c末端氨基酸序列高度保守。34种CesA蛋白序列的分子进化分析表明,大青杨PuCesA6蛋白与欧洲颤杨PtrCesA6蛋白亲缘关系最近,相似度达99％;和光皮桦BICe．sA5、大桉EgCesA6蛋白同聚为一类。     

LeWRKY2基因的克隆及功能分析

【目的】克隆番茄WRKY2转录因子,为研究番茄抗病反应的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】根据克隆出的番茄LeWRKY2基因特异片段（GenBank登录号：EU755368.1）,运用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cNDA ends,RACE）技术克隆番茄LeWRKY2 cDNA全长,并用生物信息学的方法对其进行分析。用实时荧光定量PCR方法检测番茄经JA、番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、放线菌酮（cycloheximide）刺激时LeWRKY2基因的表达情况。【结果】①从番茄中克隆到一条全长为1 007 bp的cDNA序列,命名为LeWRKY2基因,阅读框471 bp,编码156个氨基酸。②LeWRKY2蛋白含有1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构,可能具有转录、转录调控、信号传导功能。③100 μmol•L-1 茉莉酸（jasmonic acid,JA）刺激番茄幼苗0-60 min时,LeWRKY2基因的相对含量与JA刺激时间成正比;而刺激60-150 min时,LeWRKY2基因的相对含量与JA刺激时间成反比;④番茄灰霉菌可以诱导LeWRKY2基因的的表达,且在4 h时表达量达到最高;⑤LeWRKY2基因的转录产物的合成不依赖于蛋白质的从头合成。【结论】LeWRKY2是一种参与番茄防御反应的早期快速反应基因。     

花生抗病基因的克隆及功能分析

课题目标、内容：利用基因芯片技术和构建cDNA差减杂交文库分离黄曲霉抗性相关基因,获得黄曲霉抗性相关的ESTs和干旱胁迫诱导差异表达的ESTs30～50条,并在GenBank注册。     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的功能分析

运用克隆的苎麻纤维素合成酶(BnCesA1)基因cDNA及植物表达载体pWM101,构建了35S启动子控制的苎麻BnCesA1基因核心区段反义融合表达载体(pWM-BnCesA),并通过根癌农杆菌介导法将其转化至模式烟草WS38,获得了转基因烟草.对转基因烟草植株进行的分子检测和初步组织学研究表明,转反义BnCesA1基因核心区段对纤维素的合成产生干扰,植株叶柄切片初生组织细胞较野生烟草松散,其基本组织细胞涨大,间隙也相应增大,证实BnCesA1基因的纤维素合成功能,表明BnCesA1基因在植物初生组织和次生组织的细胞壁合成中都发挥作用.     

棉花黄萎病相关基因GhMYB6的克隆与功能分析

【目的】克隆陆地棉MYB家族基因GhMYB6,并对其在棉花抗黄萎病反应中的功能进行初步探究,为挖掘棉花抗病相关基因及棉花抗病育种提供参考。【方法】基于棉花转录组测序数据,筛选并克隆了响应黄萎病菌侵染的基因GhMYB6,对其序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在黄萎病诱导下的表达模式,并利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步验证棉花抗黄萎病中的生物学功能。【结果】克隆获得的GhMYB6基因开放阅读框(ORF)为258 bp,编码85个氨基酸残基,理论等电点(pI)为9.34,脂肪系数为73.41,平均疏水性为-0.793,相对分子质量为9.86 kD,不稳定指数为73.41,为亲水性、碱性的非跨膜蛋白,无信号肽,定位于细胞核,在第11~63氨基酸处含有1个SANT结构域。GhMYB6蛋白与雷蒙德氏棉GrMYB6聚在同一小分支上,说明二者的亲缘关系较近。GhMYB6基因在V991侵染后6和12 h时相对表达量较对照(未侵染处理,CK)极显著下调(P<0.01),72 h时显著上调(P<0.05,下同),24和48 h时与CK无显著差异(P>0.05)。与阴性对照植株TRV:00相比,GhMYB6基因沉默植株萎蔫程度和叶片黄化更严重,病情指数显著升高,茎秆的褐变程度更严重,且茎段在培养基上生长的真菌菌丝数量明显增多。【结论】GhMYB6基因响应黄萎病菌V991侵染,当抑制GhMYB6基因表达后,棉花对黄萎病菌的敏感性增强,抗性明显降低,推测GhMYB6是棉花抗黄萎病防御的一个正向调节因子。     

玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆玉米Zea mays淀粉合成酶SSⅡa启动子,并分析其功能,为进一步研究和应用SSⅡa启动子奠定基础。【方法】通过NCBI上公布的玉米基因组序列,在网站Maize GDB上BLAST查找到SSⅡa 5'侧翼序列,利用PCR方法从玉米B73中克隆SSⅡa启动子;通过Plant Care在线分析启动子顺式作用元件,用特异性引物分别克隆出长度为1 407、867、633、483和365 bp的片段,与植物表达载体p CAMBIA3301连接,构建5种5'缺失体的植物表达载体,命名为P1、P2、P3、P4和P5。用农杆菌介导法转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得转基因拟南芥。【结果】以玉米B73基因组DNA为模板,用特异性引物SSⅡa F/SSⅡaR进行扩增,得到2 526 bp序列;除草剂筛选的阳性拟南芥植株PCR验证均检测出gus基因;GUS组织化学分析表明,5种类型启动子构建的表达载体在成熟期叶片、果荚中均显蓝色;gus基因定量分析表明,成熟期5种转基因拟南芥叶片中,gus基因表达量P1最高,其他基本一致;种子中gus基因表达量P1和P2相近,且高于P3、P4和P5。【结论】成功克隆玉米SSⅡa启动子;构建的5种SSⅡa启动子缺失体表达载体在转基因拟南芥中均具有活性,长度为1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的启动子具有胚乳特异性。     

苹果U6启动子的克隆及功能分析

【目的】U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异。迄今在苹果（Malus×domestica）上对U6启动子尚缺乏研究。因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系。【方法】利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase,LUC）的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较。【结果】苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA（E-value<3e ^-40）,分别位于第6、7、9、10、15和17号染色体上,取5′端27 bp snRNA及其上游1 500 bp作为候选U6启动子。序列比对结果显示,苹果U6启动子与拟南芥相同,均具有两个保守的元件,包括上游序列元件（Upstream sequence element,USE）和TATA-Like box。瞬时转化后荧光素酶活性检测结果显示,10号染色体上的U6启动子转录活性最高,10号染色体上5′端截短的U6启动子（长度分别为1 500、959、275和116 bp）中275 bp的启动子活性最强。另外,在苹果愈伤组织中,苹果U6启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6启动子。【结论】从苹果基因组克隆6条U6启动子,并筛选出一条转录活性高且片段长度较短的U6启动子。     

蝗虫节律基因pdp的克隆及功能分析

[目的]研究不同条件下蝗虫（Locusta migratoria）节律基因pdp（Pyruvate dehydrogenase phosphatase）的mRNA表达水平,进一步揭示蝗虫节律的分子机制。[方法]通过中国科学院动物研究所内的转录组数据库中找出pdp基因的原型来设计引物,以群居型东亚飞蝗的头部的反转录cDNA为模板,克隆出pdp基因的全序列。把一天24 h等分成8个点,进行定时取样,以qRT-PCR技术进行不同时段pdp基因表达量的测定;并在不同处理条件下。测定pdp基因的表达量。[结果]节律基因pdp在蝗虫的不同处理条件下变化不大。[结论]该研究对了解飞蝗节律规律、种群特点及有效防虫具有重要的现实意义。     

玉米ZmCKX1基因的克隆及功能分析

利用RT-PCR技术,从玉米自交系郑58中克隆了编码细胞分裂素氧化酶1的基因(Zm-CKX1),该基因阅读框全长为1 608bp,编码535个氨基酸,蛋白质分子量为57kD,理论等电点pI=5.22。该基因与TaCKX1、AtCKX在核苷酸水平上同源性分别为69%、49%。通过实时荧光定量PCR的方法对该基因的表达模式进行了分析,结果表明,在玉米雌穗中随着授粉时间的延长,ZmCKX1基因表达量逐渐升高,并且ZmCKX1基因在郑单958及其亲本、安玉5号及其亲本雌穗中的表达量明显不同,表现为超低显性表达模式。因此推断,ZmCKX1基因可能是一个与杂种优势相关的基因。     

巴西橡胶树FCA基因的克隆及功能分析

FCA基因是植物自主开花途径中的重要调控基因,已被证实是促进植物开花的保守基因。研究通过巴西橡胶树甲基化文库获得橡胶树HbFCA基因一段434bp的保守cDNA 序列,应用RACE技术,成功克隆得到橡胶树的HbFCA基因。进一步通过构建HbFCA真核过表达载体pXCS-HbFCA-HAStrep,并转化拟南芥发现,转基因植株35d后已经抽薹开花,野生型对照未开花,HbFCA的过表达能显著促进拟南芥开花。