肠出血性大肠杆菌O157∶H7 toxB基因缺失株的构建

为了明确肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157∶H7大质粒pO157编码的蛋白质ToxB与O157∶H7在肠道黏附、定殖的关系,构建含有toxB基因同源臂的重组自杀性质粒pMEG375-BN-Kan-BC,转化SM10宿主菌获得重组SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)。将SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)与O157∶H7进行混合培养,通过同源重组,获得杂交toxB基因缺失株。用体外接种的HEp-2细胞和体内感染链霉素处理的小鼠,明确缺失株黏附定殖能力。经PCR和Western blot鉴定,toxB基因被卡那霉素(Kan+)选择标记基因表达盒所代替。O157∶H7(△toxB)生长特性与亲本株相比无明显差异。O157∶H7(△toxB)与亲本株相比,对HEp-2细胞的黏附能力降低了2倍。口服感染小鼠后,O157∶H7(△toxB)第3 d粪便排菌量仅为3.1×105 CFU,持续排菌11 d;而亲本株排菌量高达4.03×107 CFU,持续排菌时间超过14 d。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 eae基因原核表达及间接ELISA的初步建立

对肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7 LEE毒力岛上的eae基因进行克隆与原核表达,以表达产物紧密素(intimin)为包被抗原,初步建立O157∶H7血清抗体间接ELISA。结果表明,抗原最佳包被浓度为0.88μg/mL,血清最佳稀释倍数为200;与鸡大肠杆菌其他血清型O1、O2、O11、O18、O35、O45、O78、O86、O88、O147、鸡白痢以及新城疫等血清均无交叉反应,该方法特异性较好;血清稀释倍数为1 600倍时仍能检测到O157∶H7 intimin特异性抗体,该方法灵敏度较高。     

大肠杆菌O157:H7 eaeA基因的原核表达

将含广东分离株大肠杆菌O157: H7 021210 eaeA基因的克隆质粒双酶切后,亚克隆至原核表达载体pET-28a( ),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,正确构建了原核重组表达质粒pET-eaeA.再将该重组质粒转化E.coli BL21 (DE3) pLysS, 经IPTG诱导, 进行SDS-PAGE,结果显示,目的蛋白的相对分子质量约为94 000,与 eaeA基因蛋白的理论值相符.破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式存在.表达蛋白经初步纯化,3次免疫新西兰兔,获得抗 eaeA蛋白的多克隆血清.经琼脂扩散试验和Western-blotting试验,表明该蛋白具有较好的免疫原性和反应原性.     

肠出血性大肠杆菌O157：H7检测方法研究进展

大肠杆菌O157:H7检测方法的研究是目前比较热门的话题,建立快速、准确的检测方法是临床快速诊断的重要内容.文章主要介绍了大肠杆菌O157:H7各种检测方法的特点及其研究进展.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究#br#

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Intimin和Tir-Tccp蛋白质对小鼠的免疫保护性

为了研究不同浓度的肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白质对接受1010 CFUEHEC O157:H7小鼠的免疫保护作用,将Intimin和Tir-Tccp蛋白质和佐剂充分乳化后,通过皮下多点注射免疫小鼠,对照组注射等量的磷酸盐缓冲液.共免疫2次,间隔14d,末次免疫后14d...     

牛羊肉中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测

[目的]为青海省部分地区市售的羊肉、牛肉进行了大肠杆菌O157∶H7的检测.[方法]样品先用mEC肉汤增菌,然后在选择性培养基TC-SMAC培养,再根据GenBank上已发表的大肠杆菌O157∶H7 rfbE、fliC 和 eacA 抗原基因的保守序列设计3对引物,进行多重PCR鉴定,将可疑菌接种于MUG-LST,进行微量生化试验鉴定.[结果]在各1株牛、羊肉分离菌中多重PCR同时扩增出了大小为678、560和368 bp的3条特异性条带,分离菌的生化反应特性符合大肠杆菌的特征.[结论]在羊、牛肉各1份样品中检出了E.coliO157∶H7.     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE与fliC基因的表达及鉴定

利用PCR技术将肠出血性大肠杆菌O157:H7 的rfbE与fliC基因片段分别克隆到pET原核表达系统,在E.coli BL21(DE3)中表达.结果显示rfbE、fliC以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经His-Bind镍柱纯化目的蛋白,在E.coli BL21(DE3)中表达的rfbE、fliC具有良好的免疫活性.     

减少出血性大肠杆菌O157：H7的牛新疫苗

减少出血性大肠杆菌O157：H7的牛新疫苗     

遗传标志性基因Z0372 PCR检测肠出血大肠杆菌O157:H7

肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157:H7是重要的食源性病原菌,导致严重的人兽共患病。本文旨在建立以Z0372基因为靶基因的PCR检测技术,特异性检测EHEC O157:H7。以Z0372基因为靶序列,设计引物,建立Z0372-PCR,分析敏感性、特异性,并检测模拟阳性污染样品。结果表明,Z0372-PCR对纯培养物检测限103~104CFU/m L,模拟阳性污水样和肉样,增菌后检测限10~102CFU/m L(g)。非大肠杆菌O157和其他肠道病原全部为阴性扩增,只有肠出血性大肠杆菌O157:H7扩增出清晰而特异的条带。模拟阳性样品检测,条带特异,无任何杂带,测序与Gen Bank序列高度同源。因此,Z0372-PCR是特异性检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的技术,操作简便,成本低廉,适合实验室肠道内容物、刮取物、污水和食品等的快速检测。     

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ.分泌抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将E.coli O157:H7(EHEC-O157:H7)用甲醛灭活、超声破碎,免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞;与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,获得7株分泌抗E.coli O157:H7单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株,分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3,Ig亚类分别是IgG2aκ、IgG2aκ、IgG1κ、IgMκ、IgMλ、IgMκ和IgG2aκ.用间接ELISA检测,E7和F1细胞培养上清液的效价为1.6×103,腹水效价均为1×1011;C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～2×102,腹水效价均为1×103.相加ELISA结果显示,F1、G9和G11 3株mAbs对应相同的抗原表位,而其它4株对应不同的抗原表位.用间接ELISA分析特异性,7株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应.Western blotting表明,C3、E7和F1 3株mAbs在蛋白分子量28×103处有特异性条带,而其它4株mAbs则未显示蛋白带.     

出血性大肠杆菌O157：H7的Tir与stx1／2B融合基因的构建和表达

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157：H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗．其中亚单位疫苗具有很大优势。方法：构建表达tir和stxb的融合基因。将tir基因中间295个氨基酸残基（Tir295）与stxB亚基基因72个氨基酸串联。构建pET28a—stx2b—Tir295-stx1b重组质粒,将其转化于BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,经SDS--PAGE电沫检测,该融合蛋白获得了高效表达。结果：薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30％左右。结论：由于该融合蛋白由Tir、stx1b和stx2b三部分抗原组成．可刺激机体产生针时转位紧密素受体（Tir）和志贺毒素（stx）的抗体,在EHEC0157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。     

大肠杆菌O157:H7氟苯尼考耐药菌株与敏感菌株的蛋白组学差异

[目的]分析大肠杆菌O157:H7氟苯尼考耐药菌株与敏感菌株的差异表达蛋白,从蛋白组学层面揭示大肠杆菌O157:H7对氟苯尼考耐药性的产生机制.[方法]提取大肠杆菌O157:H7氟苯尼考耐药菌株(RS2-256)和敏感菌株(RS2)的全菌蛋白,经同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)标记后进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析,质谱数据通过Mascot v2.2鉴定,并根据COGs数据库对差异表达蛋白进行GO功能注释和分类.[结果]RS2菌株获得3385个肽段,RS2-256菌株获得3955个肽段,合计7340个肽段,其中6975个肽段为特有肽段,分属于1039个蛋白.与RS2菌株相比,RS2-256菌株有145个蛋白表达差异显著(P<0.05),占检测蛋白总数的13.96%,其中,上调表达蛋白有87个、下调表达蛋白有58个.表达差异蛋白按照功能进行分类,可分为外排泵、转运蛋白、细胞膜形成、应激调控、核糖体结构、DNA复制、转录、翻译、翻译后修饰、能量产生和转化、氨基酸转运和代谢、辅酶转运和代谢、糖转运和代谢、脂肪代谢、离子转运和代谢、细菌运动性、转座及信号通路共18类;多药物外排泵亚基AcrA和AcrB、外膜蛋白TolC、外膜蛋白X等52个蛋白的表达变化在3.00倍以上,占表达差异蛋白总数的35.86%.[结论]外排泵AcrAB-TolC家族、ABC家族、外膜蛋白、毒性调节器B、饥饿蛋白等在大肠杆菌O157:H7对氟苯尼考耐药性产生过程中发挥重要作用,同时涉及细菌糖代谢、氨基酸代谢、离子转运、DNA损伤与修复、生物膜及毒素与抗毒素系统等生命活动.     

出血性大肠埃希菌O157∶H7广东分离株对小鼠致病性的研究

探索肠出血性大肠埃希菌Escherichia coli O157∶H7广东分离株021210(NalR)[以下简称O157∶H7 021210(NalR)]对小鼠的半数致死量(LD50),揭示其在小鼠体内产生的病理变化.将20日龄的昆明鼠随机分组,饮水中加入萘啶酮酸预处理,消除肠道杂菌,再分别以不同剂量腹腔注射O157∶H7 021210(NalR),进行临床观察和病理学检查.测定出LD50,试验结果表明一定剂量的O157∶H7 021210(NalR)可引起小鼠主要脏器及肠道发生病变.     

大肠杆菌O157:H7在部分市售鸡肉和鸡蛋中的污染状况调查

【目的】对广州市、江门市、东莞市、乌鲁木齐市、喀什市和博乐市的多家农贸市场采集的生鸡肉及鲜鸡蛋样本,了解部分市售的生鸡肉及鲜鸡蛋被大肠杆菌O157:H7污染的情况。【方法】样品经EC肉汤增菌、免疫磁珠富集后,用SMAC平板和MUG培养基进行初步筛选,再用rfb E和fli C基因对筛选后的可疑菌株做PCR检测,同时结合生化实验的方法进行符合性检验。【结果】所有的66份鸡肉和97枚鲜鸡蛋中均未检出大肠杆菌O157:H7。【结论】被检地市售的生鸡肉和鲜鸡蛋未被大肠杆菌O157:H7污染,食用时相对比较安全。     

牛羊肉中肠出血性大肠杆菌O_(157):H_7的检测

[目的]为青海省部分地区市售的羊肉、牛肉进行了大肠杆菌O157:H7的检测。[方法]样品先用mEC肉汤增菌,然后在选择性培养基TC-SMAC培养,再根据GenBank上已发表的大肠杆菌O157:H7rfbE、fliC和eacA抗原基因的保守序列设计3对引物,进行多重PCR鉴定,将可疑菌接种于MUG-LST,进行微量生化试验鉴定。[结果]在各1株牛、羊肉分离菌中多重PCR同时扩增出了大小为678、560和368 bp的3条特异性条带,分离菌的生化反应特性符合大肠杆菌的特征。[结论]在羊、牛肉各1份样品中检出了E.coli O157:H7。     

大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒试纸条的研制

建立大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒免疫层析法。方法：首先将荧光纳米颗粒与大肠杆菌O157：H7单抗共价偶联,制成大肠杆菌O157：H7单抗-荧光纳米颗粒偶联物。用该偶联物代替金标颗粒,以双抗体夹心作为反应模式来制备大肠杆菌O157：H7免疫层析试纸条。在紫外灯下观察免疫层析试纸条上经免疫反应而产生的质控线和检测线上的荧光信号,并利用荧光强度来半定量检测大肠杆菌O157：H7。结果：用所制备的试纸条对11属24种54株菌进行检测,所有27株大肠杆菌O157：H7的检测结果呈阳性．其它非大肠杆菌O157菌株检测结果呈阴性。用该试纸条检测人工污染的鸡肉样品。灵敏度为2．7×10^4CFU／mL。通过观察检测线的有无。可对大肠杆菌O157：H7进行半定量检测。分别用所制备的大肠杆菌O157：H7免疫层析试纸条和标准法检测57份样品,2种方法的总符合率为80．7％。结论：大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒检测试纸条的研制成功,为大肠杆菌O157：H7的快速检测提供了一个极好的检测方法．便于野外检测的开展．具有广阔的应用前景。     

大肠杆菌O157：H7检测方法的研究进展

肠出血性大肠杆菌O157：H7是一种新型人兽共患病原菌,其感染具有暴发流行性、高度的致病性和致死性。目前,许多国家仍存在大肠杆菌O157：H7暴发与流行,发病呈上升趋势,对人类健康构成极大威胁,己成为全球性的公共卫生问题。因此,应用特异、灵敏、快速的检测方法和技术检测该病菌的分布是预防其暴发流行的重要环节。本文就大肠杆菌O157：H7检测方法的研究进展做一综述。