Exendin-4基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据GenBank中已公布的编号为AAB2200的Exendin-4氨基酸片断,及酵母密码子偏好性,设计了Exendin-4在酵母中的表达序列。利用基因工程技术,将编码Exendin-4的蛋白基因亚克隆到含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达栽体pPIC9K-E4。用电转化法将线性化的pPIC9K-E4转化入毕赤酵母菌株GSll5,转化子经MD平板筛选,得到的阳性菌株再用浓度梯度递增的G418筛选多拷贝重组子。将MM和MD平板筛选得到Muts菌株用甲醇诱导表达6d,每隔24h取样。Tricine-SDS-PAGE检测结果显示,诱导后第6天表达量达到最高。     

猪α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达

利用PCR技术从长白猪全血基因组DNA中扩增出猪α干扰素的成熟肽(mPoIFN-α)基因,并将其亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母(Pichia pastoris)-大肠杆菌(Escherichia coli)穿梭质粒pPIC9K载体中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFN-α。将SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFN-α电转化毕赤酵母GS115株(组氨酸缺陷型),使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组。转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以G418抗性梯度法筛选多拷贝重组子。该多拷贝菌株经1%甲醇诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明,猪α干扰素在毕赤酵母中成功地获得了分泌表达,并具有免疫活性,表达产物约为19kD,这为进一步研究猪α干扰素的功能奠定了基础。     

在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究

将化学合成的人溶菌酶基因htYZ（444bp）构建到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ上;载体质粒用SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母菌株GS115,在含Zeocin的抗性培养基筛选后PCR鉴定获得了9株重组菌株。重组菌株经甲醇诱导后取表达上清液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,重组hLYZ在毕赤酵母中成功表达,在诱导60h时表达量最高。用镍亲和层析柱纯化重组hLYZ,用Bradford法测得其含量约为324mg·L^-1。比浊法活性测定结果显示所表达的重组人溶菌酶活性达到4473U·mL^-1。本研究利用毕赤酵母分泌型表达载体成功表达了重组人溶菌酶,井探索了简单有效的纯化和活性测定方法,为利用毕赤酵母系统规模化生产重组人溶菌酶奠定了技术基础。     

人乙酰胆碱酯酶(hAchE)基因4个分泌型酵母表达载体的构建

设计合成3条引物,以载体pcDNA3．1-hAchE为模板,扩增出两端带有EcoRⅠ的约1．8kb去除信号肽但保留18bp分子内伴侣序列的hAchE结构基因,及去除信号肽序列与分子内伴侣序列的hAchE成熟肽基因。将两个基因插入到酵母分泌型表达载体pPIC9和pHIL-S1,获得正向插入的4个分泌型酵母表达载体。为转化酵母,筛选分泌型高效表达hAchE菌株奠定了基础。     

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多,却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子-GAP启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX,成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPHα。并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn2为报告基因进行功能验证,结果表明,该载体可实现xyn2基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU替换载体上原有的α-Factor信号肽,结果表明,INU信号肽能够有效引导XYNII的分泌。     

整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达

人源溶菌酶作为一种天然的抑菌活力物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。本研究将信号肽序列和人源溶菌酶基因碱基序列作为一个整体进行密码子优化。并在优化的信号肽序列2处位置,共新插入39个碱基,构成增长的优化信号肽+溶菌酶优化基因。将2种优化的信号肽+溶菌酶基因碱基序列分别插入pPICZαA载体上,并整合到毕赤酵母KM71的基因组上,获得重组子K1(整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因)和K4(整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因又整合了增长信号肽)。摇瓶诱导表达72 h后,离心取上清液,通过Bradford法和比浊法测定发现,K4的蛋白质表达量和酶活力均高于K1。5 L发酵罐下,采用高密度诱导表达策略,诱导54 h后K4的总蛋白质表达量可达3.02 g/L,所表达的人源溶菌酶活力达到324 072.0 U/ml。表明整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因又整合了增长信号肽有利于提高溶菌酶的分泌效率,实现高效表达。     

土曲霉植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

参考已报道的植酸酶基因phyA全序列设计一对引物,用PCR方法从土曲霉穴Aspergillusterreus雪总DNA中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4kb的phyA基因编码区片段,对该片段进行了克隆与序列测定。进一步用该片段构建了pPIC9K-phyA分泌型表达载体,并转化毕赤酵母穴Pichiapastoris雪GS115。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳分析,植酸酶在重组转化子中得到了有效分泌和高效表达。摇瓶诱导发酵132h后发酵液中植酸酶的活性可达167u·mL-1;表达产物在pH2.0～8.0均有活性,最适pH为5.5,最适温度为55℃。     

新城疫病毒F48E9株F-HN蛋白融合基因在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术拼接新城疫病毒F蛋白基因和HN蛋白基因,并将构建好的融合基因克隆到载体pET28a,经测序后融合基因插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOX I和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白F-HN.重组质粒pPIC9K-F-HN经Sac Ⅰ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,经G418筛选得到转化...     

黑木耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质研究

应用SignalP 3.0 Server软件对黑木耳漆酶基因lac1(GenBank No.AY450405)编码的蛋白质序列进行分析,发现在其N端存在18个氨基酸的信号肽序列。通过RT-PCR克隆了lac1基因,分别构建带有自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPICN-lac1和以α因子信号肽替换自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPIC9-lac。将这两个载体转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞,获得基因工程菌GS115-pPICN-lac1与GS115-pPIC9-lac。SDS-PAGE分析和酶活性测定结果表明,在转化后者中漆酶基因得到了有效分泌表达,而在转化前者中漆酶基因未能得到有效分泌表达。进一步研究确定GS115-pPIC9-lac菌株液体发酵的最适pH为4.0,在此发酵条件下,其分泌表达的漆酶最高酶活为0.149U·mL-1。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.0,在最适反应条件下其pH稳定性和热稳定性均较好。     

枯草芽孢杆菌分泌载体构建及其对脂肪酶A的分泌表达

[目的]构建含不同信号肽编码序列的枯草芽孢杆菌分泌表达载体,并研究这些载体对脂肪酶A的分泌表达效率。[方法]克隆得到枯草芽孢杆菌168株的脂肪酶A编码基因,同时扩增得到蛋白质NprE、Bpr、YweA的信号肽编码序列,构建了脂肪酶A分泌表达载体pMA5-estA、pMA5-nprE-estA、pMA5-bpr-estA和pMA5-yweA-estA,并转化到枯草芽孢杆菌168株中得到相应的重组分泌表达菌株。[结果]对4株重组表达菌株进行摇瓶培养,所有菌株都实现了脂肪酶A的分泌,20 h后,168（pMA5-bpr-estA）的细胞外脂肪酶A的酶活力达到1.68 U/ml,约占该菌株脂肪酶A总表达量的86%。[结论]枯草芽孢杆菌Bpr信号肽对脂肪酶A具有较高的分泌效率。     

1,1'-二茂铁衍生物的合成研究

对5种二茂铁衍生物的合成方法进行了研究,优化了以乙酰氯作为酰化剂来合成1,1’-二茂铁二乙酮和用次氯酸钠作氧化剂来合成1,1’-二茂铁二甲酸的方法,另外还改进了用MnO2氧化1,1’-二茂铁二甲醇合成1,1’-二茂铁二甲醛的方法,使反应时间缩短,后处理方便且产率有了很大的提高.     

渭北旱塬冬小麦籽粒PPO活性和YP含量基因型的分子检测

籽粒多酚氧化酶(PPO)活性和黄色素(YP)含量是影响小麦面粉白度的2个重要因素。为了解渭北旱塬冬小麦控制PPO活性(Ppo-A1和Ppo-D1)和YP含量(Psy-A1和Psy-B1)基因位点的等位变异组成和分布,本研究利用其功能标记PPO16、PPO18、PPO29、YP7 A、YP7 A-2、YP7 B-1和YP7 B-2,对46份渭北旱塬小麦品种的4个位点等位变异进行检测与分析。结果表明,渭北旱塬小麦品种在控制PPO活性Ppo-A1位点存在2种等位变异,即Ppo-A1 a和Ppo-A1 b,分别占48.3%和54.3%;在Ppo-D1位点也存在2种等位变异,即Ppo-D1 a和Ppo-D1 b,分别占54.3%和48.3%。2个位点存在4种等位变异组合类型,即Ppo-A1b/Ppo-D1 a(最低PPO活性)、Ppo-A1a/Ppo-D1 b(最高PPO活性)、Ppo-A1b/Ppo-D1 b(较低PPO活性)、Ppo-A1a/Ppo-D1 a(较高PPO活性),分别占34.8%、28.2%、17.4%、9.6%。在控制YP含量Psy-A1位点存在2种等位变异,即Psy-A1 a和Psy-A1 b,分别占56.5%和43.5%,没有发现含Psy-A1 c等位变异品种;在Psy-B1位点,存在3种等位变异,其中以Psy-B1 a为主(52.2%),Psy-B1 b次之(41.3%),Psy-B1 c较少(6.5%)。控制YP含量2个主效位点存在6种不同变异组合类型,以Psy-A1 a/Psy-B1 a(较高YP含量)比例最高(39.1%),Psy-A1 b/Psy-B1 b(最低YP含量)(28.3%)次之,其次为Psy-A1 a/Psy-B1 b(中等YP含量)(13%)和Psy-A1 b/Psy-B1 a(较低YP含量)(13%),以Psy-A1 a/Psy-B1 c(最高YP含量)(4.3%)和Psy-A1 b/Psy-B1 c(2.1%)比例最低。总体来看,渭北旱塬地区小麦含低PPO活性的基因等位变异组合所占比例较高,较高YP含量的等位变异组合所占的比例较高。     

基于RTK差分GPS的平地机作业质量评估

为了取得平地机作业质量数据,评估RTK差分GPS平地机作业质量效果,对853农场约0.3 hm~2水田进行了搅浆平地试验。先使用了传统的农田作业质量评估方法来对其进行简单的初步评估,为了得到更加准确的评估数据,再使用了精确的农田质量评估方法。评估结果表明,使用RTK差分GPS平地机进行农田平地作业,能够满足农田平整精度要求。     

高职园林技术专业“1＋1＋1”工学结合人才培养模式研究

为了提高人才对社会需求的适应能力,以职业为导向,以能力为本位,以任务为载体,就苏州农业职业技术学院3年制高职园林技术重点专业建设为例,积极探索和研究工学结合人才培养模式在专业建设上的创新思路及主要实施途径。     

基于生物量的油菜叶曲线模型

叶片是油菜最主要的光合器官之一。为定量描述油菜主茎叶曲线,基于2011~2012年和2012~2013年不同品种、移栽密度及施肥水平油菜田间试验,通过观测不同处理油菜叶片的长度、切角、弦角和弦长,分析了直叶片叶曲线方程的生物学意义,构建了直叶片概率模型;假设并验证了弯曲叶片叶曲线方程,定量了叶弯曲度与生物量的关系,构建了叶曲线模型。结果显示,直叶片概率在归一化叶位区间(0,0.4]和(0.4,1]内趋势不同,可用分段函数拟合;叶弯曲度随生物量的增大而减小,可用倒数函数拟合。所建模型利用直线方程模拟直叶片叶曲线,用二次函数模拟弯曲叶片叶曲线。经独立试验资料检验,所建模型对直叶片概率及叶弯曲度均具有较好预测性。     

紫山药黄酮醇合成酶DaFLS1基因的克隆和表达分析

为了解黄酮醇在紫山药中的合成特点,利用3'-和5'-RACE技术从紫山药中分离到黄酮醇合成酶Da FLS1基因编码序列(Gen Bank登录号:KJ022640)。Da FLS1基因编码序列全长为1 113 bp,其开放阅读框长度为1 005 bp,编码334个氨基酸。Da FLS1蛋白质属于水溶性胞质不稳定蛋白质,无跨膜区和信号肽结构。保守区域分析结果显示,Da FLS1蛋白质属于α-酮戊二酸和二价铁离子依赖型的加氧酶家族[2OG-Fe(II)Oxygenase superfamily];Da FLS1氨基酸序列与水仙(AFS63900)同源性最近(75%),其次是洋葱(AAT68476,74%),与金鱼草(ABB53382)的同源性仅为66%。系统进化分析结果显示,紫山药与其他作物亲缘关系较远。Da FLS1在紫山药幼嫩叶片中表达水平最高,并且在紫山药幼叶中的表达有2个高峰期,而在其他组织中的表达量极低或不表达,即Da FLS1在紫山药中的表达情况符合黄酮醇合成酶基因(FLS)的特征。上述结果说明,得到的基因为紫山药黄酮醇合成酶基因Da FLS1,具有FLS基因的生物信息学特征和表达特征。     

GC含量丰富的人Ⅰ型原胶原蛋白基因片段克隆及其序列分析

鉴于做转基因牛羊乳腺生物反应器的需要,根据GenBank中所公布的人Ⅰ型原胶原蛋白基因序列设计引物,利用健康人的胎盘中提取的基因组DNA为模板,通过优化的长距离PCR,成功地克隆出GC含量丰富的人Ⅰ型原胶原基因组DNA片段,序列测定与分析的结果显示中国人Ⅰ型原胶原蛋白基因组DNA片段与GenBank中所公布出来的序列所对应的部分有99.5%的同源性,其中外显子部分与GenBank中的对应部分完全一致;而在内含子中,本研究克隆到的基因与GenBank中公布出来的序列有不少差异,尤其表现在内含子1和2中,其中内含子2要比GenBank中公布的基因内含子2多出14个碱基,这14个碱基具体有什么作用尚需要进一步阐明,内含子间的差异凸显了东西方人种之间基因序列的多态性.     

残膜对土壤水分运移的影响

采用室内模拟的方法对残膜影响土壤水分运移进行了研究。结果表明,残膜会阻碍土壤水分向上移动,而且残留量和残膜面积越大,阻碍作用越明显。此外,残膜对土壤水分下渗有一定的促进作用。     

农业企业知识型员工的人际信任与知识共享关系研究

知识型员工之间的知识共享是实现个体知识集体化的主要方式,是农业企业获得核心竞争力的重要途径。在回顾人际信任与知识共享关系的基础上,引入知识共享意愿作为中介变量,着重探讨农业企业知识型员工的认知信任与情感信任能否通过知识共享意愿对知识共享行为产生影响。研究表明,高水平的认知信任、情感信任都会对知识型员工的知识共享行为产生积极影响,其中认知信任对知识共享行为的影响较为显著;人际信任通过知识共享意愿对知识共享行为产生积极影响。     

江苏淮北部分小麦品种品质性状相关重要基因的检测

为了解江苏淮北小麦品种重要品质性状相关基因状况,以20份近期审定的徐麦系列和淮麦系列小麦品种以及12份小麦对照材料为试验材料,采用SDS-PAGE电泳与PCR检测相结合,检测了小麦高分子量麦谷蛋白亚基;同时采用共显性PCR标记筛查1BL/1RS易位系以及Wx基因突变型。结果显示,江苏淮北小麦品种Glu-A1位点含3种亚基,其中1亚基占75%;Glu-B1位点有4种亚基,7+8亚基占60%;Glu-D1位点有3种亚基,5+10亚基占50%;1BL/1RS易位系有14份,占全部品种的70%;所有品种均为Wx基因野生型。