番茄花药特异表达启动子LAT52的克隆与表达载体构建

采用半巢式PCR方法,从番茄基因组中扩增出了花药特异表达启动子LAT52。该序列与GenBank公布的同源序列相似度达98%,并鉴别到一个TAAAAAA简单重复序列。将LAT52启动子与GUS基因拼接,构建成了双元表达载体。     

橡胶树hbYKt基因植物表达载体构建及亚细胞定位

SNAREs（soluble-N-ethyl-maleimide-sensitive factor attachment protein receptor,可溶性N-乙基马来亚酰胺敏感因子附着蛋白受体）参与囊泡运输,在植物中具有非常广泛和重要的生物学功能。我们从橡胶树胶乳消减cDNA文库中筛选获得橡胶树的SNARE基因,命名为hbYKt。为进一步研究该基因功能,构建了以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）为报告基因的融合植物表达栽体pCAMBIAl304h-bYKt,通过农杆菌介导法分别转化洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞。荧光显微镜检测结果表明hbYKt定位在洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞的细胞质膜中。     

拟南芥AtHOS10基因的克隆及其表达载体的构建

AtHOS10基因对植物冷调节起到重要作用,可以通过控制ABA合成来改变植物的脱水胁迫耐性。本文利用PCR方法从Columbia生态型的拟南芥基因组中扩增出冷调节基因AtHOS10,并插入克隆载体。序列分析表明,克隆片段长3453bp,与目前发表的序列完全一致。将pUC-AtHOS10和pBI-HEM进行酶切重组构建表达载体pBI-AtHOS10,然后将表达载体转化导入农杆菌中,为侵染烟草作准备。     

利用甘薯质体同源片段构建多顺反子表达载体

本研究利用质体基因组的进化保守性,根据烟草质体基因组全序列设计引物,从甘薯（lpomoea batatas L．）质体基因组中克隆了两个相邻的功能基因rbcL（GenBank登录号为AY942199）和HaccD（GenBank登录号为AY942200）,以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。选用水稻质体基因组强启动子prm及psbA3’非翻译区调控选择标记基因aadA和报告基因gfp,构建多顺反子表达盒prm—aadA-gfp-psbA-3＇,之后将表达盒克隆进甘薯质体同源片段中,获得甘薯质体多顺反子定点整合表达载体pSAG,酶切鉴定结果表明所构建的载体符合预期设计。这为后期甘薯质体转化体系的建立和通过质体基因工程手段将更多目的基因导入甘薯进行遗传改良奠定了基础。     

拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建

为探究AtHEMA1基因转化植物后对叶绿素合成机制的影响,本实验设计特异引物,以拟南芥基因组DNA为模板,采用PrimStar HS DNA聚合酶扩增AtHEMA1基因。将AtHEMA1基因克隆至载体pVCT2101,获得植物表达载体pVCT2298。     

番茄果实中NEVER—RIPE基因的克隆及其反义表达载体的构建

从粉红期番茄果实中提取总RNA，根据Genebank中NEVER－RIPE（即NR基因）cDNA序列，设计合成特异性引物，用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）进行cDNA扩增，获得一个715bp左右的扩增产物，克隆于pGEM-T easy载体，测序确定其正确性。将该扩增产物反向克隆到植物表达载体pBI121中，通过PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。将重组表达质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。     

克氏杆菌gldA基因亚克隆及其原核表达载体构建

甘油脱水酶(glycerol dehydratase EC 4．2．1．30)是控制甘油分解和产生1，3-丙二醇的关键性限速酶。甘油脱水酶是由α、β和γ3个亚基组成的复合物(α2β2γ2)，分别由gldA、gldB和gldC基因编码。研究(Frank et al.1998;Macis et al.,1998;Markus et al.,1996)认为甘油脱水酶α亚基无论在甘油脱水酶的结构上还是功能上都起到重要的作用。本研究克隆了克氏杆菌的甘油脱水酶α亚基基因(gldA)并构建了该基因的原核表达载体，为甘油脱水酶基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。     

木质素合成关键酶基因CCR的克隆及其反义表达载体的构建

木质素是植物体中总量仅次于纤维素的第二大有机物质，占次生物质总量的95％以上，在植物体具有一定的生理功能。但由于木质素含量过高使造纸工业中污染增加、饲草消化吸收率降低，因此木质素含量基因调控已成为植物基因工程研究的一个重要方向。羟基肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoAreductase，CCR)可还原3种羟基肉桂酸的     

毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建

SEP（SEPALLATA）类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1,基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA—box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、BoxI和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE—motif以及胁迫响应元件HSE、TC—richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1,protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

酿酒酵母耐铜基因CUP1的克隆及其植物表达载体的构建

酿酒酵母铜金属硫蛋白（ｃｏｐｐｅｒ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,Ｃｕ－ＭＴ）,属于第Ⅱ型金属硫蛋白,Ｃｕ－ＭＴ由酿酒酵母耐铜基因ＣＵＰ１编码,由６１个氨基酸残基组成,其中半胱氨酸残基１３个,占Ｃｕ－ＭＴ总氨基酸数的２１．３％,Ｃｕ－ＭＴ与铜离子有较强的结合力,在酵母细胞中主要参与过量铜的解毒作用。本研究通过ＰＣＲ方法,从酵母基因组ＤＮＡ中扩增出了ＣＵＰ１基因,克隆于ｐＵＣ１９的多克隆拉点。扩增     

乳腺高效表达拟蛛丝蛋白基因载体的构建及其克隆策略

6条长约80bp的寡聚核苷酸链，通过其互补末端延伸补平成3条双链DNA；3条双链DNA按3：1：3混合，PCR扩增得到大量拟蛛丝蛋白基因单体；将单体多聚化，加上设计好的信号肽和终止密码子，再将多聚体基因构建到乳腺高效表达载体pBC1上，使之成为乳腺高效表达的拟蛛丝蛋白基因载体。着重讨论了基因构建过程中DNA克隆技巧和策略。     

猪骨骼肌NDUFS7基因的克隆、染色体定位和表达谱分析

摘要：本研究用辐射杂种克隆板对猪的NDUFS7基因进行了染色体的物理定位，克隆了该基因的完整CDS序列，用相关软件进行了基因结构和功能的预测，并用半定量RT-PCR技术分析了NDUFS7基因在猪的11种组织以及在33天、65天、90天胚胎和成年猪的骨骼肌中的表达情况。分析结果首次将NDUFS7基因定位于猪的2号染色体２q21-q24， 与标记 SW395紧密连锁。该基因的CDS全长648bp，编码215个氨基酸，预测编码的产物具有一个高度保守的与能量生成有关的NouB结构域和３个酶的磷酸化位点。同时，RT-PCR结果显示，NDUFS7基因在猪的11种组织中均有表达，但表达量有差异；在不同发育阶段的骨骼肌中，65天和90天胚胎时的表达量较高，而33天胚胎和成年猪的表达量相对较低。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

含两种抗真菌基因植物表达载体的构建

近年来,植物抗真菌病害基因工程研究日益受到重视．并取得了显著进展,目前主要是通过转几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因来提高这两种酶在植物体内的表达水平,以此增强抗真菌病害的能力。体外抑菌实验表明：β-1,3-葡聚糖酶能够抑制某些真菌的生长,而一旦与几丁质酶共同作用时,其抑菌作用会大大增强。本实验将几丁质酶和葡聚糖酶     

牡丹PsMADS5基因的克隆、表达及载体构建

以牡丹品种赵粉（Paeonia suffruticosa L.cv.Zhao Fen）为试材,采用RT-PCR和RACE法从花瓣中获得了1个牡丹SEPALLATA基因cDNA,命名为PsMADS5,GenBank登录号为HQ449569。其cDNA全长1222bp,包含190bp的5＇非编码区、302bp的3＇非编码区...     

小鼠肾组织中EGF基因的克隆及其植物表达载体的构建

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是由53个氨基酸组成的单链多肽，在临床上具有重要的应用价值。由于天然EGF来源有限，用基因工程方法生产EGF蛋白已成为一个重要的替代途径。本研究用RT—PCR法从小鼠的肾组织中克隆了EGF基因，并构建到植物表达载体上，为EGF基因在高等植物细胞中的表达奠定基础。     

指导的基因在动物乳腺特异性表达载体的构建

为了实现外源蛋白质在动物乳腺中特异性表达,采用ＰＣＲ法扩增了ＢＬＧ ３’端含第６,７外显子及ｐｏｌｙ（Ａ）加尾信号下游约２００ｂｐ的０．８７ｋｂ片断。以山羊ＢＬＧ ５’的３．２ｋｂ（含第１,２外显子）启动子,山羊ＢＬＧ ３’０．８７ｋｂ序列,鸡α－珠蛋白基因簇π基因上游的－２．４￣－５．３ｋｂ ＨｉｎｄⅢ序列,绿色荧光蛋白ＧＦＰ及原核载体ｐＧＥＭ－７ｚｆ构建了ｐＧＥＭ－７ｚｆ－ＧＦＰ－ＭＡＲ－５’     

香石竹ACC氧化酶基因克隆及其反义表达载体构建

据已报道的香石竹氨基环丙烷羧酸(ACC)氧化酶基因的cDNA序列设计特异引物,以香石竹品种“Master”基因组DNA为模板,用PCR方法克隆出香石竹ACO基因的部分序列。测序结果显示,克隆的序列与已报道序列基本一致。将克隆的香石竹ACO片段反向连接到植物表达载体pCAMBIA 1301中CaMV 35S启动子的下游,构建了香石竹ACO基因的反义表达载体pCAM-ACO2,为进一步通过反义技术延长转基因香石竹的花期奠定了基础。     

香蕉乙烯受体基因RNA干扰表达载体的构建

设汁两对引物，PCR扩增香蕉乙烯受体基因cDNA序列自AUG启始密码子起长538bp区段的正向(记为5‘I)、反向(记为AI’)DNA区段。构建含该正、反向互补重复序列DNA片段的中间载体，经测序证实连接正确后。克隆到植物表达载体pCAMBIA-1301中的GUs基因位置并经双酶切证实。在所得表达载体pCAMBIA-1301-S5’I-AI’中，该插入正反互补重复片段处于35S启动子之后，由此转录的mRNA因两端序列反向互补而形成发夹式RNA，因此可应用于RNA干扰研究。同时，文中对构建含正、反向重复序列插入片段植物表达载体过程中出现的插入片段链内退火引起连接困难等问题进行了分析讨论。