云南切梢小蠹热激蛋白20基因克隆及序列分析

[目的]对云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)成虫热激蛋白20基因(TynHSP20)进行克隆和序列分析,为研究该虫在高温环境下的抗逆机制打下基础.[方法]采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆云南切梢小蠹成虫TynHSP20基因cDNA序列,并对其序列进行生物信息学分析.[结果]克隆获得的TynHSP20基因cDNA序列长671 bp,含开放阅读框597 bp,5'端非编码序列和部分3'端非编码序列分别为44和33 bp.该基因编码198个氨基酸,预测蛋白质分子量为22.50 kD,等电点为7.86,包含一个保守的α-晶体蛋白结构域.同源性比对分析结果表明,TynHSP20蛋白氨基酸序列与东亚飞蝗、蓼蓝齿胫叶甲、斜纹夜蛾和美洲斑潜蝇的HSP20氨基酸序列相似性均低于20%.系统发育分析结果显示,TynHSP20与沙葱萤叶甲的亲缘关系较近.[结论]成功克隆获得TynHSP20基因cDNA序列,该基因具有小热激蛋白家族的特征,但与其他物种小热激蛋白的同源性较低.     

云南切梢小蠹细胞色素P450基因的克隆与分析

利用RACE技术,从云南切梢小蠹Tomicus yunnanensis中克隆获得了一个细胞色素P450基因cDNA序列。该基因简写为TyunP450,其序列长1 524 bp,开放性阅读框为1 269 bp,编码422个氨基酸,预测蛋白分子量为48.50 ku,pI为8.94。通过MotifScan分析发现,TyunP450氨基酸序列中潜在1个酰胺化位点(XGR265-268)、4个N-糖基化位点(NLSV33-36、NDSV87-90、NGST97-100和NASK372-375)、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸位点(SVTE176-179、TQRD187-190、SDED217-220和TIDE420-423)、5个N-豆蔻酰化位点(GNVFGF2-7、GNVYND40-45、GGQNAA163-168、GGILSD213-218和GTNIAI340-345)、8个蛋白质激酶C磷酸化位点(SLK77-79、STK99-101、TQR187-189、SLK210-212、SLR288-289、SHK417-419、SLK431-433和TLR443-445)、1个P450细胞色素血红素铁配体的半胱氨酸位点(FSSGPRDCLG384-393),204~316氨基酸区域具有典型的细胞色素P450结合位点结构,317~441氨基酸区域具有典型的细胞色素P450结合位点结构,9~28氨基酸区域具有DUF321蛋白的未知函数结构域,1~441氨基酸区域具有典型的细胞色素P450结合位点结构。TyunP450与埃及伊蚊Aedes aegypt、家蚕Bombyx mori、丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis、赤拟谷盗Tribolium castaneum和豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的P450氨基酸序列相似性分别为19%、20%、21%、23%和15%。     

切梢小蠹蛀食云南松枝梢行为研究

横坑切梢小蠹(Tomicus minor)和云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)是两种重要的松属(Pinus)蛀干害虫,通过蛀梢危害与蛀干危害共同致死云南松(Pinus yunnanensis)。通过林间自然调查,对横坑切梢小蠹和云南切梢小蠹蛀食枝梢影响因素进行了探讨。结果表明,蛀梢坑道长度与枝梢长度和蛀梢直径呈显著相关,且切梢小蠹侵入枝梢的部位也很大程度上决定了蛀梢坑道的长度,二者显著相关。研究发现,影响横坑切梢小蠹蛀梢坑道长度的主要因素为侵入孔位置,而影响云南切梢小蠹的主要因素为枝梢长度,枝梢直径,侵入孔位置。     

盘县云南切梢小蠹的发生规律及防治研究

云南切梢小蠹为云南松的重要蛀干害虫,本文通过在贵州盘县开展云南切梢小蠹的危害及防治研究,总结了云南切梢小蠹在盘县的分布、生活史、危害等特征及防治措施,为该虫的防治研究提供重要基础信息。     

云南切梢小蠹蛀食云南松枝梢行为研究

云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)通过蛀梢危害与蛀干危害共同致死云南松(Pinusyunnanensis)。通过野外自然调查,对云南切梢小蠹蛀食枝梢影响因素进行了探讨。结果表明,云南切梢小蠹蛀梢坑道长度与枝梢长度和蛀梢直径呈显著相关,且云南切梢小蠹侵入枝梢的部位也很大程度上决定了蛀梢坑道的长度,二者显著相关。研究发现,影响云南切梢小蠹蛀梢坑道长度的主要因素为:枝梢长度,枝梢直径,侵入孔位置。     

云南切梢小蠹气味结合蛋白的分子对接

为研究云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)参与其嗅觉识别过程的机理,基于气味结合蛋白、绿叶挥发性物质的三维结构,采用分子对接方法对云南切梢小蠹OBP与3个绿叶挥发性物质可能的结合方式和结合能力进行模拟,结果表明,(E)-2-己烯醇较其他2个小分子而言更容易与云南切梢小蠹OBP结合,形成稳定的氢键。(E)-2-己烯醇与Tyun OBP2结合能最低,更容易与Tyun OBP2结合,Tyun OBP2与小分子物质的结合,可能通过占有该蛋白与寄主气味结合的空间或者通过改变Tyun OBP2三维结构,导致Tyun OBP2难以识别寄主松树散发的气味。     

短毛切梢小蠹微卫星富集文库的构建与分析

采用生物素-磁珠富集法,构建短毛切梢小蠹微卫星富集文库。在该文库中随机挑选100个克隆作测序分析,结果表明：具微卫星位点的克隆占91％;具有10次以上碱基重复次数的微卫星序列占36％,其中最高碱基重复次数为63次;在这些微卫星序列中,完美型占47．3％,非完美型占24．2％,混合型占16．5％。表明获得的微卫星文库是高质量的文库,完美型的比例高于不完美型和混合型,与真核生物微卫星序列特征相符。     

不同非寄主植物对云南切梢小蠹嗅觉行为的影响

将云南松针与藏柏、樟树、滇青冈等非寄主植物叶片配成0g:6g、1g:5g、2g:4g、3g:3g、4g:2g、5g:1g、6g:0g 7种比例置于"Y"型嗅觉仪反应臂中作为气味源.对照臂置6 g云南松针,观察云南切梢小蠢的嗅觉行为.结果表明:当非奇主在混合叶片中的比例较小时,非寄主植物对云南切梢小蠹的嗅觉行为影响较小.云南松针与非寄主叶片以4g:2g、5g:1g两种比例混合时,与混合叶片中全为云南松针(云南松针与非寄主叶片比例6g:0g)相比,对云南切梢小蠹的诱引率相差小,最大相差8%.随着非寄主叶片所占比例的逐渐增大,叶片混合物对云南切梢小蠹的诱引率越来越小.当云南松针与非寄主叶片以1g:5g、2g:4g两种比例混合时,与混合叶片中全为云南松针相比,对云南切梢小蠢的诱引率下降最大值分别为32%和26%.     

云南松林分状况与松纵坑切梢小蠹危害的关系

通过对云南省3个蠹害区的观测研究，证实云南松林分自身状况与松纵坑切梢小蠹危害关系密切。就云南松个体而言，根据林木生长分级标准，松小蠹主要危害被压木及濒死木，很少危害优势木及亚优势木；就林分整体而言，同一山体的东坡和南坡林分的蠹害程度重，西坡和北坡林分的蠹害程度轻。林缘蠹害程度明显高于林内；林分郁闭度与蠹害指数呈负相关，郁闭度越低蠹害越严重。研究证实，松小蠹有明显的趋光行为，即阳坡林分、林缘、低郁闭度林分容易遭受松小蠹侵袭。     

滇朴和旱冬瓜叶片挥发物对云南切梢小蠹卵黄原蛋白及其受体基因转录的影响

通过荧光定量PCR分别检测它们在不同发育阶段（卵、幼虫、蛹及成虫）以及雌成虫不同组织（头、胸、翅、卵巢、腹部残体）中的表达量,并检测了它们于两种非寄主叶片挥发物处理不同时间后的表达量,分析非寄主滇朴和旱冬瓜叶片挥发物对云南切梢小蠹卵黄原蛋白基因（Vg）及其受体基因（VgR）表达量的影响。结果表明：Vg和VgR基因在蛹和成虫中的表达量高于其他各发育阶段,且在成虫中的表达量高于蛹中的。Vg基因在腹部残体的表达量最高,而VgR基因在卵巢中特异性表达。滇朴叶片挥发物处理20 d和40 d后,Vg基因的表达量显著降低,但处理60 d后该基因的表达量显著升高。旱冬瓜叶片挥发物20 d和40 d后,VgR基因的表达量显著减低,但处理60 d后该基因的表达量与对照相比不存在显著差异。综上所述,非寄主挥发物能通过调控云南切梢小蠹Vg和VgR基因的表达进而影响其产卵。     

6种模式生物热休克蛋白70家族的进化分析

[目的]研究柄海鞘和其他5个物种的热休克蛋白70家族的系统发育关系。[方法]通过在Ensembl中下载与筛选,获得柄海鞘和其他5种生物的热休克蛋白70家族的氨基酸序列,对其进行系统发育树和基因结构分析,并阐明其系统发育关系。[结果]经过筛选,共获得了来自线虫、果蝇、柄海鞘、斑马鱼、家鸡和人类6种生物的热休克蛋白70家族的33个氨基酸序列,其中25个具有明确的基因结构。系统发育分析表明,系统发育树并未完全按照来源物种聚类;6种生物热休克蛋白70的氨基酸序列相当保守,但其内含子插入位点并不整齐,表明热休克蛋白70家族是一个多基因、多结构的家族。[结论]这6个物种均发生了基因复制事件,新产生的基因仅仅是冗余的存在,还是具有新的功能,仍需作进一步的研究。     

香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1的克隆及序列分析

[目的]为香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1调控机理的研究奠定基础。[方法]根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的一个CBL基因片段,采用PCR方法克隆了MaCBL1基因全长cDNA序列并对其进行了初步的生物信息学分析。[结果]MaCBL1基因cDNA序列全长1 078 bp,编码213个氨基酸残基。多重序列比对结果显示,MaCBL1推导的氨基酸序列与其他植物来源的CBL基因的氨基酸序列同源性较高。遗传进化分析表明MaCBL1与其他植物如杨树、甘蓝、沙冬青、棉花和水稻的CBL基因的亲缘关系较近,并在同一个进化枝上。[结论]该研究为进一步研究香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白对香蕉生长发育、果实的成熟调控及对各种逆境反应的调控提供了依据。     

猪Sirtuin 3基因的克隆与进化分析

从猪十二指肠肠道组织提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了猪Sirtuin3基因,并与GenBank中的9个其他物种的核酸序列进行了同源性分析,采用邻接法构建了分子系统进化树。结果表明克隆的猪Sirtuin3基因长999bp,编码332个氨基酸,前21个为信号肽;猪Sirtuin3与牛、人的同源性最高,分别为86．3％、79．6％,分子进化树也表明猪的Sirtuin3与牛、人的亲缘关系最近。     

热休克蛋白在鱼类生殖中的作用研究进展

热休克蛋白(Heatshock protein,HSP)对鱼类生殖具有极其重要的作用,是提高鱼类产量与影响鱼类繁育成败的关键因素。对热休克蛋白在鱼类生殖中的作用的研究现状进行了概述,从鱼类生殖细胞的发生发育、热休克蛋白的作用机理、热休克蛋白在生殖中的调控机理等方面进行了阐述,并对今后热休克蛋白在鱼类生殖中的研究发展趋势进行了展望,旨在为我国鱼类人工繁殖建立提供科学依据,同时为水养殖鱼类种苗生产提供可控性强的工艺流程。     

牙鲆Mx基因的克隆及序列分析

对牙鲆(Paralichthys lethostigma)总RNA经反转录得到的cDNA测序。结果表明,获得的cDNA片段全长1 980 bp,其中编码区长1 890 bp,编码629个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为71.7 kDa。Blast比较以及Megalign软件分析的结果表明,此cDNA片段具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征:一个三联体GTP结合区域;一个发动蛋白家族的典型结构特征序列及C端高度保守的Leu拉链结构区。进一步的序列比较与进化分析结果表明,牙鲆Mx基因与日本比目鱼等鱼类的同源性较高,同源性达75.1%-98.7%;而与哺乳动物的同源性相对较低,同源性达50.3%-55.1%。     

热休克蛋白及其分类·特点和调节

介绍了热休克蛋白的分类,概括了热休克蛋白的独特特点,阐明了热休克蛋白在转录水平和翻译水平上的调节过程。     

狐貉源犬瘟热病毒核蛋白基因的克隆及序列比较分析

参照已发表的犬瘟热病毒(CDV)核蛋白基因(N)序列设计合成了1对引物,用RT-PCR方法对从发病狐、貉中分离的MS01、SC01、ZD01三株CDV的N基因进行扩增,并分别将其PCR产物进行克隆和测序。测序结果表明:3病毒分离株N基因阅读框架全长均为1572bp,编码523个氨基酸。利用DNAstar的MegAlign生物软件,将3病毒分离株与Genbank数据库中现有的CDV毒株的N基因序列及推导出的氨基酸序列进行了同源性比较和系统进化树分析,结果发现:3病毒分离株与强毒参考株A75/17等野毒株高度同源,核苷酸同源为96.2%～99.1%,氨基酸同源为96.0%～99.8%,而与疫苗株Onderstepoor相对较远,核苷酸同源为93.6%～94.0%。N基因的系统进化关系分析显示:3病毒分离株均归为强毒株,并且与中国新疆的TN株、中国台湾的Kaohsiung株基因型最近,表现出一定的地理位置相关性。     

石渠棘球绦虫Es95基因克隆及序列分析

[目的]首次克隆获得石渠棘球绦虫Es95基因,并进行序列分析,为研究抗包虫病候选疫苗提供理论指导。[方法]从高原鼠兔肺脏包囊上获得石渠棘球绦虫原头蚴,提取全基因组,并根据NCBI上6种棘球属绦虫95基因序列设计引物,以基因组DNA为模板扩增到Es95基因,并克隆到T载体上,测序后进行序列分析。[结果]以石渠棘球绦虫全基因组DNA为模板扩增出Es95基因长为1 330 bp,序列分析含有3个外显子和2个内含子,有1个糖基化位点,N端有一信号肽序列(16个氨基酸),C端有跨膜区(23个氨基酸),亲水性低,B细胞抗原表位预测有ES95潜在抗原表位6个。[结论]ES95是一个分泌性糖蛋白,在包虫病的预防上具有重要意义。     

水貂株犬瘟热病毒融合蛋白基因的克隆与序列分析

以犬瘟热病毒水貂分离株RNA为模板,经RT-PCR反应,扩增出融合蛋白基因的1053bp DNA片段,通过T-A克隆技术,成功构建克隆载体PMD-18T/F。序列分析表明:分离株与01-2689株、2544-Han95株、A75-17株、DOGDK91C株、00-2601株、ONP株、PDV-2株核苷酸序列同源性分别为94.3%、93.5%、94.4%、93.6%9、5.3%、97.3%和94.5%;氨基酸序列同源性分别为97.2%、96.6%、97.4%、97.4%、97.4%、97.2%和98.0%。抗原指数分析表明分离株与疫苗ONP株、强毒A75-17株在40-50位氨基酸间存在明显差异。