5 Aza dC对奶牛乳腺上皮细胞PPARγ表达的影响

为阐明DNA甲基化对奶牛乳腺泌乳功能调控的机制,研究了甲基化抑制剂5氮杂2′脱氧胞苷（5 Aza dC）对奶牛乳腺上皮细胞中PPARγ基因启动子甲基化状态及其表达的影响,以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,采用0.1、0.5、1.0、5.0μmol／L的5 Aza dC对奶牛乳腺上皮细胞进行处理,用EpiQuikTM DNA methyltransferase assay试剂盒进行甲基转移酶活性检测,采用CASY细胞分析仪检测细胞活力和增殖能力,利用亚硫酸氢盐测序（BSP ）技术检测了PPARγ启动子的甲基化特征,qRT PCR法检测PPARγmRNA表达的变化,Western blot检测PPARγ蛋白表达的变化。结果显示：与空白对照组相比,0.1μmol／L的5 Aza dC对奶牛乳腺细胞生长无毒性,处理96 h甲基转移酶活性极显著降低,奶牛乳腺细胞的PPARγ基因启动子甲基化程度降低,PPARγ表达升高。表明5 Aza dC可降低奶牛乳腺细胞中PPARγ启动子区域的甲基化程度,促进PPARγ表达。     

TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及HSP70蛋白表达的影响

【目的】探讨TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。【方法】TGF-β1作用乳腺上皮细胞不同时间,收集细胞及培养液,应用MTT检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡率、比色法检测LDH活性、琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性、Western bolt 技术分析HSP70蛋白的表达量。【结果】1、5、10 ng•ml-1的TGF-β1均能抑制乳腺上皮细胞的增殖,且随浓度增加抑制作用加大,呈现剂量依赖性,其中10 ng•ml-1 TGF-β1组与对照组差异显著（P＜0.05）;10 ng•ml-1 TGF-β1作用于乳腺上皮细胞, 随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,其中6、12和24 h与对照组相比差异极显著（P＜0.01）;LDH活力随作用时间延长而升高,12、24 h与对照组差异极显著（P＜0.01）;DNA完整性随 TGF-β1作用时间的延长发生不同程度降解;TGF-β1作用2～6 h细胞大量表达HSP70,6 h达到高峰,而后下降,2～12 h的表达量均极显著高于对照组（P＜0.01）。【结论】TGF-β1可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖,具有浓度依赖性。10 ng•ml-1 TGF-β1可以显著增加细胞凋亡率,提高细胞培养液中LDH活力,使细胞DNA发生不同程度的降解,同时HSP70蛋白随TGF-β1作用时间发生显著的表达变化。本试验结果表明,TGF-β1可以以促进上皮细胞凋亡的方式,促进奶牛乳腺发生退化。     

奶牛乳腺上皮细胞体外培养技术研究进展

奶牛乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的特殊功能,是制作乳腺生物反应器的靶细胞。以奶牛乳腺上皮细胞为试验模型,能够真实反应乳腺生长、发育及泌乳的细胞或分子生物学机制,验证乳腺组织特异性表达载体构建的合理性和有效性,对研究奶牛乳腺生物反应器、乳蛋白基因表达具有重要的意义。文章主要从培养方法、培养体系的建立、形态结构与细胞增殖分化方面阐述乳腺上皮细胞体外培养技术研究进展。     

乳脂合成前体对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞蛋白质组学影响

向奶牛乳腺上皮细胞中添加β-羟基丁酸钠,利用双向电泳技术进行细胞亚细胞蛋白质组学方面的研究。结果表明,β-羟基丁酸钠对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞蛋白表达有显著影响。Imagemaster6.0软件分析出4个表达上调的蛋白点,鉴定分别是ENO1、α-glucosidase、plastin3和ARPC2。通过实时荧光PCR检测以上蛋白在mRNA水平的表达差异,结果均有不同程度的提高,其中以ENO1、α-glucosidase及Arpc2提高显著(P<0.05)。研究所筛选出的蛋白,将有助于进一步揭示奶牛乳腺上皮细胞增殖和泌乳机制。     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

本试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响。试验结果表明0.25%胰酶＋0.2%Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5%与10%浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5%与10%浓度FBS对细胞生长没有明显的差异（p〉0.05）,但明显高于其他处理组（p〈0.01）。     

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察

本研究利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1&#215;104细胞/ml、1&#215;105细胞/ml和1&#215;106细胞/ml。经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明,当细胞接种浓度为1&#215;104细胞/ml~1&#215;105细胞/ml时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

[目的]探讨在生化培养箱中进行奶牛乳腺上皮细胞原代培养的可行性。[方法]采用组织块法,在体外进行乳腺上皮细胞的分离培养,探索其在生化培养箱中合适的培养条件。用倒置显微镜观察、细胞爬片吉姆萨染色和角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定。[结果]通过倒置显微镜观察发现,上皮细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有铺路石样。细胞染色可见上皮细胞胞体较大,胞核深蓝色,圆形或椭圆形,核仁清晰可见,一般为2-4个。免疫组化鉴定结果显示,培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白14和18。[结论]原代奶牛乳腺上皮细胞可以在生化培养箱中成功培养。     

通草提取物对奶牛乳腺上皮细胞乳糖合成及相关基因表达的影响

为探讨通草对奶牛乳腺上皮细胞乳糖合成及相关基因表达的影响,采用不同剂量通草提取物处理奶牛乳腺上皮细胞,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测乳腺上皮细胞增殖能力,乳糖/半乳糖检测试剂盒(Lactose/D-Galactose (Rapid) Assay Kit)检测乳腺上皮细胞培养液中乳糖含量,实时荧光定量PCR技术检测乳腺上皮细胞乳糖合成相关基因葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、葡萄糖转运蛋白8(GLUT8)、葡萄糖转运蛋白12(GLUT12)、己糖激酶Ⅰ(HKⅠ)、己糖激酶Ⅱ(HKⅡ)、β-1,4-半乳糖基转移酶-1(β-4GALT1)和α-乳清白蛋白(α-LA)基因mRNA表达水平。结果表明,200、400、600μg(生药)·mL-1通草提取物提高奶牛乳腺上皮细胞增殖能力(P<0.05),促进奶牛乳腺上皮细胞合成分泌乳糖(P<0.05),并显著上调细胞GLUT1、GLUT8、HKⅡ、β-4GALT1及α-LA mRNA表达水平(P<0.05),但对GLUT4、GLUT12和HKⅠmRNA表达水平无显著影响(P>0.05)。研究表明,适当浓度通草提取物可提高奶牛乳腺上皮细胞增殖能力,并通过上调乳腺上皮细胞GLUT1、GLUT8、HKⅡ、β-4GALT1和α-LA的mRNA表达,促进乳腺上皮细胞合成乳糖。     

茶多酚对氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤的保护作用

用过氧化氢(H2O2)建立体外奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激损伤模型,研究不同质量浓度茶多酚对氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤的影响。MTT法检测细胞存活率,比色法检测细胞培养液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,分光光度法检测天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的活性。结果显示:与H2O2损伤模型组相比,20～100μg.mL-1茶多酚处理组的奶牛乳腺上皮细胞存活率、SOD活性显著升高,而MDA含量、LDH与Caspase-3相对活性与细胞凋亡率均下降,其中以100μg.mL-1茶多酚处理组效果最显著,说明一定质量浓度的茶多酚可以缓解氧化应激所致的奶牛乳腺上皮细胞的损伤,提高细胞存活率,抑制乳腺细胞凋亡。结论:茶多酚对乳腺上皮细胞氧化应激损伤具有保护作用,其保护作用可能与降低MDA含量,增强SOD活性及抑制Caspase-3活性有关。     

胆碱对热应激诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响

[目的]本试验旨在揭示胆碱对热应激诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的抑制作用.[方法]奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T细胞)于含10％胎牛血清的DMEM培养基中进行体外培养,将细胞分为对照组、胆碱组(100μmol·L-1)、热应激组(42℃,2 h)、热应激+胆碱组.采用CCK-8法分析添加胆碱对MAC-T细胞的药物毒性及细...     

四种二肽对奶牛乳腺上皮细胞增殖及β-酪蛋白分泌的影响

通过添加不同浓度的二肽:蛋氨酸-蛋氨酸、赖氨酸-赖氨酸、蛋氨酸-赖氨酸、赖氨酸-蛋氨酸二肽,用CASY细胞活力分析仪检测奶牛乳腺上皮细胞的增殖和活力,用荧光定量PCR、HPLC检测β-酪蛋白的基因表达情况,确定培养24 h时四种二肽的最佳添加浓度分别为80、100、50、80μg.mL-1。以最佳二肽浓度添加时细胞的增殖分别为1.28×105、1.66×105、1.79×105、.85×105cells.mL-1,活力分别为93.72%、95.59%、94.35%、95.65%,培养液中β-酪蛋白含量分别为1.34、1.38、1.44、1.63 mg.10-5cells。为进一步利用小肽提高乳蛋白产量、调控乳蛋白合成提供理论依据。     

苦参碱对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及抗氧化能力的影响

【目的】探究苦参碱对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖、凋亡及抗氧化能力的影响。【方法】利用含0(A组),25(B组),50(C组),75(D组)和100μg/mL(E组)苦参碱的培养基培养奶牛乳腺上皮细胞。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测BMECs活性,采用流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测苦参碱对BMECs凋亡的影响,并检测苦参碱对BMECs抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的影响,采用real-time PCR对BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因的相对表达量进行检测。【结果】用药5d时,低质量浓度(25和50μg/mL)苦参碱对BMECs增殖具有促进作用,高质量浓度(75和100μg/mL)苦参碱对细胞增殖具有抑制作用;B~E组BMECs的凋亡率均极显著高于A组(P0.01);B~E组BMECs培养上清液中NO和乳酸脱氢酶(LDH)水平明显高于A组。B~E组BMECs的过氧化氢酶(CAT)活性均比A组高,其中C组极显著高于A组(P0.01);B~E组的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均极显著高于A组(P0.01),E组的超氧化物歧化酶(SOD)水平极显著高于A组(P0.01),各组MDA含量无显著性差异。与A组相比,苦参碱上调了B~E组BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因的相对表达量。【结论】低质量浓度苦参碱能够促进BMECs增殖,高质量浓度苦参碱则会抑制BMECs增殖;不同质量浓度苦参碱均可提高BMECs的抗氧化能力,其中50μg/mL苦参碱提高BMECs抗氧化能力的效果最明显。     

大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞bFGF及其受体FGFR2表达的影响

[目的]探讨大肠杆菌(Escherichia coli)对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)b FGF及其受体FGFR2表达的影响。[方法]取热灭活的0、105、106和108CFU/m L浓度的大肠杆菌作用于体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,分别在作用后6、12、24和48 h,采用荧光定量PCR和Western blot方法检测b FGF和FGFR2的mRNA和蛋白的表达情况。[结果]b FGF mRNA表达与对照组相比随着大肠杆菌浓度的升高而显著上调(P0.01),24 h b FGF表达量最高。BMEC b FGF蛋白表达随着大肠杆菌浓度的增加而上调,24 h表达量达到最高;FGFR2 mRNA相对表达量除6 h组外随大肠杆菌浓度的增加而呈现降低、升高、降低的变化趋势,48 h表达量达到最高。各处理组与对照组相比FGFR2蛋白表达随时间的延长、菌液浓度的增加而上调。[结论]大肠杆菌刺激奶牛乳腺上皮细胞可以明显促进b FGF和FGFR2的表达,具有浓度和时间依赖性。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

1材料与方法 1．1材料 1．1．1乳腺组织。从屠宰场选取健康的泌乳期奶牛,无菌手术切取乳腺实质组织,置于DMEM／F12完全培养液（含10％胎牛血清、100IU／ml青霉素和链霉素）中,尽快运回实验室。     

高温条件下miRNA-24对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的非编码小RNA分子,本研究旨在分析高温条件下miRNA-24对乳腺上皮细胞生长、凋亡的作用及其初步机制。【方法】体外培养奶牛乳腺上皮细胞,高温(41℃)处理所培养的细胞;应用miRNA基因沉默技术,抑制高温处理过的乳腺上皮细胞中miRNA-24的表达;采用细胞计数法分析细胞增殖情况;Hoechst33342/PI荧光染色、流式细胞术检测miRNA-24对乳腺上皮细胞凋亡的作用,Western blot检测凋亡相关因子表达变化。【结果】抑制miRNA-24的表达,高温条件下的乳腺上皮细胞增殖能力显著增强(P0.05),凋亡细胞数显著减少(P0.05),促凋亡因子caspases-8和caspases-3表达量下调。【结论】内源性miRNA-24对乳腺组织发育具有重要的调控作用,抑制miRNA-24的表达可以缓解高温诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡发生率、促进细胞的生长发育。     

怀孕期山羊腺垂体中IFN-α和IFN-γ的表达研究

【目的】研究α-干扰素(IFN-α)和γ-干扰素(IFN-γ)在怀孕前期(怀孕1～30d)、中期(怀孕31～120d)、后期(怀孕121～150d)山羊腺垂体中的分布及表达量的变化特点。【方法】以怀孕前、中、后期的山羊为试验动物,放血致死后采取其腺垂体制备切片,采用免疫组织化学SP法分别对怀孕前、中、后期山羊腺垂体内IFN-α、IFN-γ阳性细胞的分布及表达变化进行研究。【结果】2种干扰素阳性物质主要分布于腺垂体嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和嫌色细胞中。不同怀孕期,IFN-α和IFN-γ的分布存在明显差异,前期和后期表达量较高,中期明显降低;在前、中、后各个怀孕时期,IFN-α的相对表达量均比IFN-γ多,在后期更为明显。【结论】IFN-α和IFN-γ在山羊腺垂体中的表达量因怀孕时期的不同而存在明显差异,其可能在不同怀孕时期发挥作用或相互协同调节垂体激素的合成与分泌,参与动物生殖的调节。     

组织块种植法体外培养奶牛乳腺上皮细胞

为建立成熟的奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系,以组织块种植法培养荷斯坦泌乳期成年母牛乳腺组织,观测长出的上皮细胞在各生长时期的形态变化,绘制生长曲线并计算群体倍增时间,用免疫组化技术鉴定乳腺上皮细胞角蛋白18的表达,用SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析技术检测乳腺细胞的酪蛋白分泌情况。试验结果表明,此培养体系可获得良好的奶牛乳腺上皮细胞,原代以及传代培养,细胞增殖旺盛,长势良好;细胞骨架蛋白——角蛋白18表达为阳性,且培养的细胞具有分泌牛乳酪蛋白的功能。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

【目的】探索一种简单且高效的原代奶牛乳腺上皮细胞的培养方法。【方法】采用组织块培养法、酶消化法培养奶牛乳腺上皮细胞;通过MTT法检测吸光度绘制细胞生长曲线;通过免疫组化法鉴定角蛋白-18的表达。【结果】酶消化法相比组织块培养法获得的细胞具有耗时短,获得量高等优点,MTT法绘制的生长曲线符合一般生物学特性,呈"S"型,奶牛乳腺上皮细胞中角蛋白-18阳性表达。【结论】酶消化法是一种简单且高效的培养原代奶牛乳腺上皮细胞的方法。     

产PVL金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞内质网应激和自噬的影响

【目的】研究产PV-杀白细胞素（Panton Valentine leukocidin,PVL）金黄色葡萄球菌ATCC49775（产PVL标准菌株）、ΔPVL 49775（PVL基因缺失株）以及体外重组PVL（rPVL）对奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）内质网应激和自噬的影响,为系统阐述金黄色葡萄球菌及PVL对BMECs损伤的分子机制奠定基础。【方法】用感染复数（MOI）为30的金黄色葡萄球菌菌株ATCC49775和ΔPVL 49775感染BMECs,于感染后3和6 h取样;用100 ng/mL rPVL处理BMECs,于处理后1,3和6 h取样;以未处理的BMECs为对照（CK）。用免疫荧光法检测样品BMECs细胞的自噬体荧光强度;提取样品细胞的总蛋白,以GADPH为内参蛋白,采用Western blot法检测各处理组内质网应激相关蛋白（CHOP和GRP78）和自噬相关蛋白（LC3 Ⅱ、ATG5、Beclin1和p62）的相对表达量。【结果】ATCC49775、ΔPVL 49775感染后不同时间,BMECs自噬体荧光强度均极显著（P＜0.01）高于CK,内质网应激相关蛋白（CHOP和GRP78）和自噬相关蛋白（LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1和p62）的表达水平也大多显著(P<0.05)或极显著（P＜0.01）高于CK;同一处理时间下, ATCC49775感染组自噬体荧光强度和相关蛋白表达水平均显著(P<0.05)或极显著（P＜0.01）高于ΔPVL49775感染组。 rPVL处理后不同时间,BMECs的自噬体荧光强度均极显著（P＜0.01）高于CK,内质网应激和自噬相关蛋白的表达水平大多极显著（P＜0.01）高于CK。【结论】产PVL金黄色葡萄球菌ATCC49775、ΔPVL 49775以及rPVL均加剧了BMECs的内质网应激和自噬,说明PVL在金黄色葡萄球菌感染BMECs的过程中有重要作用。     

FLCN对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳功能的影响

FLCN基因参与多种代谢途径和细胞过程,国内外关于FLCN在奶牛乳腺发育过程中表达及调节的研究鲜有报道。应用RNA干扰技术和质粒转染技术改变FLCN基因在奶牛乳腺上皮细胞中表达量,流式细胞仪检测细胞增殖,采用qRT-PCR和Western blot检测FLCN对泌乳相关功能基因AMPK、mTOR、CyclinD1、Caspase3和β-酪蛋白表达的影响。结果表明,FLCN正向调节mTOR磷酸化水平,促进乳蛋白合成和细胞增殖,抑制细胞凋亡,负调控能量代谢调节子AMPK。FLCN在奶牛乳腺上皮细胞中可通过mTOR信号通路调控细胞增殖及乳蛋白合成,研究对揭示FLCN调控奶牛乳腺上皮细胞增殖和泌乳具有重要作用。