小鼠精原干细胞体外培养体系建立及功能鉴定

旨在通过探索ICR品系小鼠精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的体外稳定培养,为别的品系小鼠和大动物的SSCs体外培养提供参考.本研究采集6?8日龄ICR乳鼠的睾丸,用两步酶消化法(胶原酶和胰蛋白酶)和差速贴壁法来纯化SSC细胞.用不同的饲养层(小鼠胎儿成纤维细胞(mouse em...     

小鼠支持细胞体外培养的一般特性

用组合酶消化法、选择性贴壁法将7～8日龄小鼠的支持细胞分离纯化后进行体外培养,观察其体外培养的一般生物学特性.结果表明,所获细胞悬液中活细胞、死细胞及细胞团的百分率分别为90.08%,9.92%,8.91%,平均每个睾丸可获得4.136×105个细胞.接种纯化后,可获得均一的、纯度高达90%以上的支持细胞.支持细胞体外贴壁时间为7～8 h,贴壁后伸出3～4个突起,为成纤维型细胞.油红O染色显示,其胞质内含有大量脂漓.     

温度对体外培养小鼠精原干细胞的影响

将分离纯化的小鼠精原干细胞分别置于37、34、30℃及50％CO2、饱和湿度条件下进行体外培养。结果表明，3种温度下的精原干细胞均可以存活并增殖，但随着体外培养时间的延长，细胞的生长状态、增殖数量和存活时间有明显差异。34℃下细胞平均存活时间最长，增殖数量最多。统计分析显示，34℃与30、37℃下细胞平均存活时间有显著差异（P＜0．05），表明34℃是小鼠精原干细胞较为适宜的生长环境。     

血清和饲养层对水牛精原干细胞体外培养的影响

本研究首先将水牛睾丸经二步酶消化法制成单细胞悬液,依次采用差速贴壁法和Percoll不连续密度梯度离心法分离和纯化精原细胞。在制备好的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,采用含2．5％血清的培养液对精原细胞进行体外培养,观察血清和成纤维细胞对精原细胞生长的影响,并在体外成功培养了2周通过提取体外培养精原干细胞总FZNA,设计引物并对其进行基因鉴定和免疫细胞化学鉴定,证实体外培养所得的细胞仍保持有精原干细胞的特性,并且该克隆是处在未分化状态的精原干细胞形成的。上述研究可为体外建立水牛精原干细胞长期培养体系提供技术支撑。     

精原干细胞体外培养研究进展

精原干细胞（SSCs）是指位于睾丸生精小管基膜上既能自我更新维持自身群体数量恒定,又能定向分化形成精母细胞,最终形成精子的一类原始干细胞。其体外培养以及近年来兴起的移植、基因转染的深入研究,为探讨精子的发生机制、重建不育个体的精子发生、生产转基因动物提供了新的途径。文章综述了精原干细胞体外培养的研究现状,并对其体外的纯化、鉴定,以及未来的应用进行了介绍,旨在为精原干细胞的研究提供借鉴。     

小鼠精原干细胞体外培养的一般特性

将分离纯化的7～8d小鼠精原干细胞进行体外培养，结果显示，精原干细胞24h后可完全贴壁，贴壁后呈规则的圆形或卵圆形，直径(11±1)μm，以链、团状或散在方式贴附于混杂其中的睾丸体细胞层上；睾丸体细胞为多突起细胞，胞质形成2～4个突起；体外培养50～60h后，精原干细胞开始分裂。上述结果表明，在本试验培养基所提供的体外环境中，精原干细胞能够存活一定时间并发生贴壁、分裂增殖等行为。     

不同培养方法对鸡精原干细胞体外培养效果的影响

本研究从孵化至16 d的鸡胚睾丸中分离获取精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）,比较3种培养液、2种处理（有无饲养层）对SSCs生长的影响,并对SSCs保持特性进行鉴定。结果表明：在无饲养层细胞存在的条件下,DMEM、TCM199和RPMI1640培养液中,SSCs的存活时间分别为6.5、6.0和3.5 d,DMEM和TCM199培养液之间差异不显著（P〉0.05）,但两者与RPMI1640之间均存在极显著差异（P〈0.01）。在有饲养层细胞存在的条件下,在DMEM、TCM199和RPMI1640培养液中,SSCs的存活时间分别为45.5、38.0和14.0 d,三者相互之间存在着极显著的差异（P〈0.01）。在6种培养体系中,SSCs在培养体系Ⅳ中的存活时间和AKP阳性克隆率分别为（45.5±3.20）d和0.31±0.46,极显著地高于其他5种培养体系（P〈0.01）。SSCs在培养体系Ⅳ中传代至1、2和3代时,AKP阳性克隆率分别为31.6%、20%和18%。SSCs形成的克隆,经AKP活性检测和SSEA-1免疫染色,均呈阳性。传代至第3代的SSCs,其染色体组型保持不变,为2n=78。这些结果表明,SSCs在以DMEM为基础培养基的培养体系Ⅳ中培养至第3代时,仍保持干细胞未分化特性。     

精原干细胞体外培养的研究进展

精原干细胞是体内唯一的能在细胞水平进行识别并增殖、分化及调控的成体干细胞,是位于精曲小管基膜上,既能自我更新,维持自身群体数量恒定,又能定向分化产生精母细胞的一类原始精原细胞,其前体是原始生殖细胞(primord ial germ cells,PGCs)。近年来,随着精原干细胞鉴定,体外培养及冻存等技术的发展,精原干细胞的应用成为可能。文章对精原干细胞形态特征、分离纯化、体外培养及影响因素等进行综述。1精原干细胞的形态、特性及其增殖分化精原干细胞相对数量极少,仅占生殖细胞的0.02%~0.03%。睾丸中大部分的精原细胞并非干细胞,而是处于分化…     

哺乳动物精原干细胞体外培养研究进展

作者综述了哺乳动物精原干细胞体外培养的研究现状、程序及方法,并从细胞化学、免疫组织化学等方面客观评定精原干细胞体外培养的形态、结构及特征,另外,还对其体外的纯化、鉴定、应用和未来的发展方向结合自己的试验体会作了逐一说明,旨在为其体外长期培养及建系提供条件.     

小鼠生精细胞的分离和体外培养

为了建立一种操作性强、稳定、高效的小鼠生精细胞体外培养体系,从10只8周龄成年雄性健康清洁级昆明小鼠睾丸组织分离出细胞得到混悬液,采用支持细胞和生精细胞共培养方式,通过添加多种细胞培养液,以维持细胞的生长和增殖。结果表明:采用睾丸生精细胞、支持细胞共同培养的方式可得到密度较大的生精细胞,且精原细胞、精母细胞的数量占绝大多数。     

哺乳类精原干细胞体外培养影响因素

精原干细胞为体内天然干细胞，如能体外培养建系或建立其长期培养系统，将会极大地促进精原干细胞移植，转基因等技术的实际应用，也会给体外研究细胞的发育分化提供很好的材料，影响精原干细胞外存活，增殖的因素很多，该文主要综述了基本培养基的选择、血清和添加剂，激素和维生素的应用及SCF、LIF、bFGF等生长因子的作用等，以期促进精原干细胞的研究。     

蒙古马睾丸支持细胞的体外分离培养与鉴定

为研究一种简单快速分离蒙古马睾丸支持细胞并保证其活性的基本方法,本试验采集2岁蒙古马睾丸组织于低温环境下进行机械分离,将1~3 g睾丸组织剪碎,采用重力沉淀法去除游离的红细胞和间质细胞;使用0.1%胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶+EDTA逐步进行组织消化,并用含有10%胎牛血清的培养基进行细胞培养;在接种后采用差异贴壁法分离纯化支持细胞,使用Tris-HCl低渗法去除杂质细胞,并采用碱性磷酸酶（AKP）染色、HE染色、实时荧光定量PCR方法进行鉴定。结果显示,支持细胞贴壁性能较强,培养24 h后大多数细胞开始贴壁,细胞形状呈椭圆形;培养48 h后胞质增多,折光性变强;培养3~4 d细胞胞质展开紧密连接,此时细胞呈三角形,有明显的核仁,培养6~7 d细胞生长状态进入稳定期。实时荧光定量PCR结果显示,GATA4和GDNF基因在培养细胞中极显著表达（P<0.01）,AKP染色支持细胞呈阴性表达,表明分离培养的细胞确为支持细胞。本试验使用机械分离法与两步酶消化法处理组织,可快速高效地获得睾丸支持细胞,成功构建了蒙古马睾丸支持细胞体外培养方法。     

同源物种不同饲养层对鸡精原干细胞体外培养的影响

分别以鸡胚来源的不同细胞为饲养层培养精原干细胞,比较3种不同的饲养层对精原干细胞体外培养的影响。结果显示:精原干细胞在鸡胚成纤维细胞饲养层和鸡睾丸支持细胞饲养层上存活时间较长、生长增殖状况良好。在鸡胚成纤维饲养层上传至四代,每代的AKP阳性克隆率分别为45%、40%、36%和21%。在以睾丸支持细胞为饲养层进行培养时传至三代,每代的AKP阳性克隆率分别是40%、32%、和22%。而以鸡肝细胞作为饲养层,精原干细胞未见有克隆形成,不能进行传代培养,表明鸡胚肝细胞饲养层不适合培养精原干细胞。     

精原干细胞体外培养及影响因素

影响精原干细胞体外培养的主要因素有温度、饲养层细胞、细胞因子包括分化抑制因子(LIF)和生长因子(SCF和bFGF)等。本文拟对其研究进展和精原干细胞体外培养所涉及到的精原干细胞的鉴定和分离纯化技术的研究进展进行综述。     

动物精原干细胞体外培养研究进展北大核心

精原干细胞(SSCs)作为成体干细胞之一,可将遗传信息向子代传递,在雄性动物的精子发生过程中起到至关重要的作用。根据SSCs的生物学特征并通过有效的细胞分离手段将睾丸中的SSCs进行分离,进一步纯化并体外培养,才能更加深入地研究其相关机制。随着测序技术及基因编辑技术的发展和成熟,对于SSCs的研究手段和应用范围也在不断扩展。因此,文章主要对SSCs的生物学特征、鉴定、分离、纯化、体外培养以及与SSCs研究中联合使用的新技术进行了总结,以期为SSCs体外培养方法选择及其相关研究提供参考。     

鸡精原干细胞的体外培养

本试验旨在探索不同基础培养基对鸡精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）体外培养的影响,以期选出最佳的培养体系,并用其进行传代培养,以观察精原干细胞继代培养的特性。结果表明：在高糖DMEM培养体系和TCM199培养体系中,SSCs均能正常生长和增殖,在以DMEM和TC199为基础培养基的培养体系中,在SSCs的活率、克隆形成率上显著不差异,但SSCs在以DMEM为基础培养基的培养体系中生长情况较好,为最佳培养体系。在RPMI1640培养体系中,SSCs克隆形成率、活率较低,比前2种培养体系的效果差异显著。在添加细胞因子的培养基中精原干细胞在体外传至第3代。     

睾丸支持细胞可促进鸡精原干细胞体外增殖

正扬州大学的研究人员比较了层黏连蛋白、纤维连接蛋白、胶原蛋白以及睾丸支持细胞4种不同培养系统对鸡精原干细胞(SSCs)体外增殖的作用效果。采用三酶两步消化法分离SSCs,细胞经明胶差速纯化后培养,将传至3代的SSCs重新接种于层黏连蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白包被的培养皿中以及睾丸支持细胞制备的饲养层上,通过形态学、5-乙基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)细胞增殖、qRT-PCR技术检测不同培养系统对鸡精原干细胞体外增殖的作用效果。结果表明:三组基质蛋白及睾丸支持细胞都能够促进鸡SSCs的体外     

体外培养小鼠精原干细胞的研究

探讨一种新的体外培养精原干细胞的方法,为进一步研究精原干细胞增殖与凋亡提供依据。采用组合酶消化、差速贴壁法分离精原干细胞,并设计了支持细胞条件培养基、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)处理培养基以及对照培养基3种培养体系,应用细胞活力分析仪检测精原干细胞数量以及活性,精原干细胞标记蛋白c-kit受体和磷酸酶染色技术进行鉴定,激光共聚焦显微镜技术检测细胞增殖核抗原(PCNA)和BCL-2家族蛋白Bax和Bcl2表达的变化。结果:应用组合酶消化和差速贴d壁法得到了纯度70%以上的精原干细胞;在体外培养7 d以内,PCNA的表达条件培养基组明显好于GDNF处理组以及对照组,Bcl2的表达条件培养基组高于GDNF组和对照组,Bax的表达条件培养基组低于GDNF组和对照组。研究表明在7 d内体外培养精原干细胞,条件培养基明显促进细胞增殖,抑制细胞的凋亡。     

小鼠生精上皮发育中支持细胞和精原干细胞的数量变化

睾丸支持细胞(Sertoli cells, SCs)和精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)发生相应变化才能维持正常精子发生。因此,探讨生精上皮发育中两者的关系对深入了解精子发生有重要意义。基于前期基础,分别取青春期前(出生后5,10 d)、青春期(15,20 d)、近性成熟(25,30 d)及性成熟后(35,40,50,70 d)的昆明雄性小鼠,采用本室已建立的曲细精管漂浮免疫荧光染色全铺片法,测量了小鼠各阶段曲细精索/管的直径;以GATA4为SCs标记、胶质细胞源神经营养因子家族受体α-1(GFRα-1)为SSCs分子标记,显示生精上皮中的SCs和SSCs并分析其数量变化。结果显示,随日龄增加其曲细精索/管直径显著增大,特别是在性成熟前;5 d小鼠的GATA4⁺ SCs数量最少,随后快速上升,15 d时达到最高且显著高于其他各阶段(P<0.05),之后呈波动下降趋势且趋于相对稳定;GFRα-1⁺ SSCs数量也随日龄增大而增多,15 d时达到最高且显著高于其他各阶段(P<0.01),随后在...     

小鼠睾丸支持细胞体外分离培养的研究

为了研究一种能快速、高效地分离、纯化小鼠睾丸支持细胞的方法,试验采用颈部脱臼的方法处死3周龄的小白鼠,取其睾丸并去除附属组织(血管、白膜脂肪等)后剪碎,用Ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶分步消化制备细胞悬液进行培养,台盼蓝染色以鉴定细胞的活率;再对细胞悬液进行低渗溶液处理并利用支持细胞贴壁而其他细胞不贴壁的特性对其进行分离、纯化;最后对支持细胞采用H.E.和油红O染色的方法进行鉴定,观察其形态、结构和生长增殖情况。结果表明:该方法能够有效地分离、纯化以及培养小白鼠睾丸支持细胞。