睾丸酮丛毛单胞菌ATCC 11996类固醇脱氢酶3α-HSD的高效表达与纯化

利用分子克隆的方法扩增与克隆睾丸酮丛毛单胞菌ATCC 11996的3α-HSD基因,构建以pET-15b为载体的表达工程菌,IPTG诱导蛋白表达,通过优化表达菌的最佳表达条件得到最大表达量的目的蛋白.诱导后将工程菌裂解,通过硫酸铵沉淀,Ni-NTA亲和层析,分子筛分离进行纯化,并测定纯化后蛋白的酶活性.结果表明:1)克隆获得了睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因并实现了异源表达;2)工程菌的最佳表达条件为:37℃培养,0.6mmol/L IPTG诱导4h,培养基中Zn2+终浓度为0.1 mmol/L;3)表达工程菌裂解后用60％硫酸铵沉淀,亲和层析和分子筛分离后得到了纯度高达99％的目的蛋白,纯化后的蛋白保持酶活性.本试验成功克隆表达了睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因,建立了3α-HSD的高效表达与纯化方法,为相应抗体的制备与水资源中的类固醇激素检测方法的建立提供基础.     

睾丸酮丛毛单胞菌LysR基因的克隆及对3α-HSD/CR表达的调节

采用分子克隆技术构建睾丸酮丛毛单胞菌LysR基因表达载体,并通过与PAX1共转化来分析LysR基因对3α-HSD/CR在E.coliHB101的表达调节。结果表明:酶切和DNA测序显示,所构建的表达质粒pKtac1-LysR含有编码LysR的基因序列且稳定性较好;共转化结果显示,加入重组质粒pKtac1-LysR的3α-HSD/CR的表达量显著高于加入pKtac1的3α-HSD/CR的表达量(P<0.01)。     

甾类化合物降解菌D61的分离鉴定及其降解特性

从杂草土壤中分离得到利用甾类化合物作为唯一碳源的菌株D61.经16S r DNA多态性分析鉴定菌株D61为肠杆菌科哈夫尼菌属,在20~37℃、p H 2.0~9.0的环境中生长较好,无卡那霉素抗性.降解试验和荧光定量PCR试验结果表明,菌株D61可通过paa C基因的环氧化作用途径对甾类化合物进行降解转化,其对睾丸酮的降解能力与阳性对照菌睾丸酮丛毛单胞菌相似,对雌酮的降解能力明显优于睾丸酮丛毛单胞菌.     

TeiR融合蛋白分离及多克隆抗体的制备

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)基因组DNA,PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pET28a中,经酶切验证后获得teiR基因表达载体pET28a-teiR.将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,添加终浓度为1 mmol.L-1的IPTG进行诱导,提取细菌总蛋白进行蛋白的SDS-PAGE电泳.并根据融合蛋白特性,利用Ni-NTA Spin Column对TeiR融合蛋白进行分离纯化,经分离纯化后的重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出单一条带.进一步以获得的TeiR融合蛋白为抗原,制备兔抗TeiR多克隆抗体,经ELISA测定该抗体的效价为1∶10000,该抗体与睾丸酮丛毛单胞菌天然TeiR蛋白反应良好,说明该抗体特异性良好.     

全程自养脱氮体系中硝化菌株的筛选和鉴定

在建立全程自养脱氮反应器的基础上,以活性污泥为对照,分析了反应器内硝化菌和亚硝化菌的数量变化,并通过富集培养,从反应器中筛选、分离用于治理氮污染的硝化菌和亚硝化菌.研究结果表明,自养脱氮反应器内亚硝化菌数量显著增加,说明亚硝化菌积累是全程自养脱氮体系的一个显著特点.从反应器内富集到参与自养脱氮反应的细菌菌株,鉴定结果表明,参与亚硝化反应的菌株主要为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans);参与硝化反应的菌株主要为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testoseroni),同时测定了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的亚硝化能力和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testoseroni)的硝化能力.     

全程自养脱氮体系中硝化菌株的筛选和鉴定

在建立全程自养脱氮反应器的基础上,以活性污泥为对照,分析了反应器内硝化菌和亚硝化菌的数量变化,并通过富集培养,从反应器中筛选、分离用于治理氮污染的硝化菌和亚硝化菌．研究结果表明,自养脱氮反应器内亚硝化菌数量显著增加,说明亚硝化菌积累是全程自养脱氮体系的一个显著特点．从反应器内富集到参与自养脱氮反应的细菌菌株,鉴定结果表明,参与亚硝化反应的菌株主要为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和食酸丛毛单胞菌（Comamonas acidovorans）;参与硝化反应的菌株主要为睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testoseroni）,同时测定了铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的亚硝化能力和睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testoseroni）的硝化能力．     

注射ACTH对断奶母猪卵泡促黄体素受体表达及卵泡液中类固醇激素合成的影响

[目的]为了探讨应激对断奶母猪繁殖障碍的影响机制,本试验以促肾上腺皮质激素(ACTH)注射所致的应激模型来研究应激对断奶母猪卵泡液中类固醇激素合成及卵泡促黄体素受体表达的影响。[方法]对10头苏淮断奶母猪进行颈静脉插管手术,随机均分为对照组与ACTH处理组(n=5)。手术第3天开始以每次间隔8 h给ACTH处理组母猪注射ACTH(1 IU·kg-1),对照组母猪注射生理盐水,连续注射7 d。利用ELISA方法检测受试母猪卵泡液中类固醇激素及血浆中皮质醇的含量变化;利用荧光定量PCR测定胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1)、17α-羟化酶(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)、类固醇激素合成急性期调节蛋白(St AR)、3β羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、促黄体素受体(LHR)等基因的表达;利用免疫组化法检测CYP17A1、CYP19A1、LHR和3β-HSD蛋白的表达。[结果]人工注射ACTH后40%的受试母猪出现排卵障碍;其血浆中皮质醇的含量极显著升高(P0.01);母猪卵泡液中雌二醇、雄烯二酮含量均显著下降(P0.05);CYP17A1、CYP19A1、LHR和3β-HSD基因表达量降低,其编码的蛋白CYP17A1、CYP19A1、LHR和3β-HSD表达量也明显下降。[结论]ACTH注射所致应激过程中,受试母猪的皮质醇含量升高可导致类固醇合成酶的基因、蛋白表达量明显下降,从而影响类固醇激素的合成及卵泡的发育。类固醇激素合成降低及LHR的低表达影响断奶母猪的正常排卵。     

3α-HSD单克隆抗体的制备及其鉴定

为制备抗3α-HSD蛋白单克隆抗体(MAb),以已表达纯化的高纯度3α-HSD蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,经过免疫和细胞融合后筛选出特异性的抗3α-HSD蛋白单克隆抗体,成功冻存35株IgG类型阳性杂交瘤细胞株。对14号和20号Anti-3α-HSD进行亲和性测试,发现其与可溶性抗原蛋白的亲和常数分别为3.7E+09和4.2E+09,二者可与抗原牢固结合,具有良好的亲和性。     

藏鸡和肉鸡种蛋皮质酮沉积与胚胎皮质酮代谢酶表达的差异分析

[目的]糖皮质激素(GC)对禽类的胚胎发育至关重要,其生物活性主要受细胞内的糖皮质激素代谢酶的调节。本研究比较了藏鸡和肉鸡种蛋内的皮质酮沉积水平以及胚胎卵黄膜、尿囊膜的皮质酮代谢酶11β-羟基类固醇脱氢酶1(11β-HSD1)、11β-羟基类固醇脱氢酶2(11β-HSD2)和20-羟基类固醇脱氢酶(20-HSD)的表达水平差异。[方法]采用酶联免疫方法检测藏鸡和肉鸡种蛋蛋黄、蛋清内的皮质酮含量,用荧光定量PCR检测14胚龄藏鸡和肉鸡鸡胚卵黄膜、尿囊膜11β-HSD1、11β-HSD2、20-HSD基因的表达情况。[结果]藏鸡蛋蛋黄内皮质酮含量极显著低于肉鸡蛋黄内含量(P<0.01),而两者间蛋清内皮质酮含量没有显著差异(P>0.05)。14胚龄藏鸡卵黄膜11β-HSD2、20-HSD mRNA表达量显著或极显著低于肉鸡(P<0.05或P<0.01);藏鸡鸡胚尿囊膜11β-HSD1、11β-HSD2、20-HSD mRNA表达水平显著或极显著高于肉鸡(P<0.05或P<0.01)。除了藏鸡鸡胚20-HSD基因,同一品种的皮质酮代谢酶基因在卵黄膜上的表达量都高于尿囊膜内含量。[结论]藏鸡和肉鸡种蛋皮质酮沉积及卵黄膜、尿囊膜的皮质酮代谢酶的表达差异在一定程度上可解释品种间表现性状差异的原因。     

甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成及增殖的影响

[目的]本试验旨在探究甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成功能以及增殖的影响。[方法]首先采用免疫组化法鉴定甲状腺素受体(TRα/β)在猪卵巢组织的表达情况,随后体外培养猪卵巢原代颗粒细胞,选取低(10-8mol·L~(-1))、中(10-7mol·L~(-1))、高(10-6mol·L~(-1))3种浓度的甲状腺素(T4)孵育24 h,采用酶联免疫法检测细胞培养液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平,并采用蛋白印迹法检测颗粒细胞内激素合成相关酶蛋白(3β-HSD、CYP19)的表达情况。采用MTT法检测各浓度甲状腺素对细胞活力的影响,利用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光染色验证不同浓度甲状腺素对颗粒细胞增殖的影响。[结果]免疫组化结果显示:TRα/β在猪卵巢不同发育阶段卵泡的颗粒细胞、膜细胞中有广泛表达,在卵母细胞的胞质中也有分布,在闭锁卵泡中也见明显表达。猪卵巢原代颗粒细胞经甲状腺素处理后,细胞培养液中的孕酮和雌激素水平都显著低于空白对照组(P0.05),并且各剂量处理组间孕酮呈现出剂量依赖性降低趋势;雌激素在低浓度和高浓度甲状腺素处理组较中浓度处理组高。蛋白免疫印迹结果显示:与对照组相比,3β-HSD和CYP19蛋白在较高浓度甲状腺素(10-7和10-6mol·L~(-1))处理组的表达量均显著降低(P0.05);而在低浓度甲状腺素(10-8mol·L~(-1))处理组,CYP19蛋白表达量显著降低(P0.05),但3β-HSD蛋白表达无显著差异。此外,MTT细胞毒性和增殖试剂盒检测结果显示:不同浓度甲状腺素处理并不影响细胞活力,这与PCNA免疫荧光强度统计结果一致,进一步证实了甲状腺素对原代颗粒细胞增殖没有影响。[结论]甲状腺素能够作用于卵巢颗粒细胞,干扰类固醇激素的合成,其作用机制可能是通过改变激素合成相关蛋白3β-HSD和CYP19的表达来完成的。而甲状腺素对颗粒细胞激素合成的干扰效应并不影响细胞增殖状态。     

雌二醇对香猪睾丸中SF-1和3β-HSD及NOS表达的影响

为探明外源雌二醇(E2)对香猪睾丸中类固醇生成因子-1(SF-1)、3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)和一氧化氮合酶(NOS)表达的影响,以便进一步探讨雌激素影响睾丸生殖功能的作用机制,将12头1日龄雄性贵州香猪随机平分为对照组(空白)、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组,试验Ⅰ~Ⅲ组从2日龄连续9d经腹腔每头每天分别注射E20.1mL、0.5mL和2.5mL,26日龄时手术取出左侧睾丸,采用酶联免疫吸附法测定SF-1、3β-HSD及NOS的含量。结果表明:与对照组相比,试验Ⅰ~Ⅲ组睾丸中SF-1、3β-HSD和NOS的表达量显著升高(P0.05)。其中,SF-1的表达量随E2用量增加显著升高(P0.05);3β-HSD的表达量在E2用量为0.5mL/(d·头)时最高,在2.5mL/(d·头)时表达量又下降(P0.05);NOS的表达量各试验组间差异不显著(P0.05)。E2能够促进新生香猪睾丸中SF-1、3β-HSD及NOS的表达。     

亚硝化单胞菌is79a3 Sec途径分泌系统及底物蛋白分析

[目的]分析亚硝化单胞菌is79a3 Sec途径分泌装置及底物蛋白。[方法]从NCBI中选取亚硝化单胞菌is79a3菌株基因组注释的蛋白质氨基酸序列,采用Blast程序搜寻基因组中编码Sec途径分泌装置的蛋白,同时采用Signal P 4.0、Lipo P、TMHMM 2.0软件分析该菌株基因组中Sec途径的底物蛋白,同时采用COG功能数据库进行功能分析。[结果]通过分析发现亚硝化单胞菌is79a3菌株编码Sec途径分泌装置有关的蛋白15个,包含Sec途径分泌系统中12个转运蛋白编码基因,1个信号肽识别蛋白编码基因和2个信号肽酶蛋白编码基因;Sec途径底物蛋白分析结果显示366个含有Sec途径Spase I类肽酶识别的信号肽,36个蛋白只含有Spase II类肽酶识别的信号肽。402个Sec途径底物蛋白功能分析结果显示:有272个蛋白功能不清楚,130个蛋白有具体的功能注释。[结论]亚硝化单胞菌is79a3 Sec途径分泌装置完整,该菌株Sec途径底物蛋白大多数没有功能注释和功能未知,在有功能注释的蛋白中,主要参与细胞壁/细胞膜的生物合成、蛋白质翻译后修饰/蛋白更替、无机离子转运代谢、能源产生与转换。     

2种野生岩生植物叶片可溶性蛋白含量对低温胁迫的响应

[目的]研究植物叶片可溶性蛋白质含量与植物抗寒性的关系。[方法]以野生岩生植物金发草和丛毛羊胡子草作为研究材料,并以目前最常用的护坡植物狗牙根作为对照,研究低温胁迫下2种野生岩生植物叶片可溶性蛋白含量的变化情况,并对蛋白质进行SDS-PAGE分析。[结果]结果表明:在低温胁迫下,丛毛羊胡子草、金发草和狗牙根的可溶性蛋白含量随处理温度的降低而增大;在各处理温度下丛毛羊胡子草可溶性蛋白含量均明显高于金发草和狗牙根,并且3种草可溶性蛋白含量12月高于8月;3种草12月蛋白质SDS-PAGE分析表明,丛毛羊胡子草蛋白质条带数最多且条带着色深,金发草次之,狗牙根蛋白质条带数最少且条带着色浅。[结论]3种草种中,丛毛羊胡子草具有较强的抗寒性。     

黄单胞菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白的研究进展

黄单胞菌借助保守的III型分泌系统,将多个效应蛋白注入植物细胞,克服宿主的防卫,利于黄单胞菌在植物体内发挥毒性功能。最近对III型效应蛋白致病机理开展了大量研究,结果发现具有酶功能的效应蛋白在黄单胞菌及其宿主间的相互作用中发挥非常重要的作用。此外,黄单胞菌存在一类独特的III型效应蛋白(Avr Bs3家族)。迄今为止,仅在黄单胞菌和雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中发现Avr Bs3家族效应蛋白,Avr Bs3家族通过模拟转录激活子来操纵寄主植物易感基因的表达。     

1株苯并[a]芘高效降解菌的分离鉴定

以苯并[a]芘为唯一碳源反复驯化,从长期受苯并[a]芘污染的土壤中分离筛选出1株高效降解苯并[a]芘的菌株A12,经形态及生理生化特征分析,初步鉴定为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)。菌株A12在苯并[a]芘质量浓度为5 mg/L、温度为28℃条件下,振荡培养12 d,苯并[a]芘的降解率可达到28%。     

嗜水气单胞菌脂肪酸生物合成途径相关蛋白的耐药性

嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila是一种广泛存在于水体与土壤的人-畜-鱼共患病原菌。本课题组前期研究发现生物被膜状态下嗜水气单胞菌在抗生素金霉素的胁迫下,脂肪酸生物合成途径中相关蛋白表达上升,但具体特性与功能尚不明确。为进一步探究这些蛋白在抗生素胁迫下的变化规律与功能,设计引物克隆乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶α亚基(AccA)、乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶β亚基(AccD)、酰基载体蛋白质合成酶(FabB)以及丙二酸单酰辅酶A酰基载体蛋白酰基转移酶(FabD)。通过比较各高表达菌株在金霉素作用下的生存率,来分析相关蛋白的耐药特性。结果表明,高表达AccD、FabB和FabD蛋白能够显著提高细菌在抗生素胁迫下的生存率,而高表达AccA蛋白则只在前期提高细菌存活率。此研究揭示脂肪酸生物合成途径相关蛋白在细菌的耐药过程中起重要作用,也为后续研究嗜水气单胞菌的耐药机制提供了实验依据。     

植物病原黄单胞菌DSF信号依赖的群体感应机制及调控网络

群体感应是微生物之间相互交流的一种重要联络方式,它协助细菌能感应群体密度从而调节基因表达。20世纪80年代以来,多种群体感应信号及其传导机制得以阐明。DSF（diffusible signal factor）是近年来在野油菜黄单胞菌中首先鉴定的1个新型群体感应信号,化学结构为顺式11?甲基?2?十二碳烯酸,其信号传导途径包括RpfC/RpfG双组分感应系统、二级信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）、全局性转录因子Clp等。在野油菜黄单胞菌中,DSF群体感应信号调控3类生物学功能：一是促进致病相关基因的表达;二是抑制生物膜形成;三是促进黄单胞菌作出代谢调整,适应高群体密度环境。RpfF是DSF信号生物合成过程中的关键酶,黄单胞菌在高群体密度条件下通过一种新型自我诱导机制大量合成DSF。DSF信号不仅存在于所有黄单胞菌属细菌中,也广泛存在于苛养木杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、伯克氏菌、铜绿假单胞菌和许多海洋细菌中,其传导途径和生物学功能还有待进一步阐明。     

甲磺隆降解菌的降解特性及降解体系

利用睾丸酮丛毛单胞菌(菌株C.tes+ act5)具有消化多环芳烃类化合物这一特性,以甲磺隆为底物筛选其降解甲磺隆的培养条件,使甲磺隆在土壤中的含量相对降低,以期为高效降解环境中多环芳烃类物质奠定基础.研究结果:菌株C.test+act5降解甲磺隆的最适底物浓度为200 ～ 300 μg/mL,最适温度为30℃,最适pH值为6.0.在此条件下培养36 h,甲磺隆的降解效率达70％以上,培养72 h甲磺隆几乎完全被降解.     

环丙沙星对睾丸酮丛毛单胞菌CT1降解4-氯硝基苯作用的影响

为了研究环境中抗生素对4-氯硝基苯(4-chloro-1-nitrobenzene,4-CNB)生物降解的影响,本文选用9种高效降解4-CNB的菌株开展试验,并通过药敏试验研究了18种常用抗生素对菌株CT1的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。采用4-CNB-环丙沙星联合培养,研究了不同浓度环丙沙星作用下菌体浓度、细胞活性、总超氧化物歧化酶(SOD)及降解性能的变化。结果表明:睾丸酮丛毛单胞菌CT1降解4-CNB效率最高,27℃9 h降解效率为98.4%±0.2%。仅6种抗生素存在MIC值,其中环丙沙星的MIC值最低,为4μg·mL~(-1);链霉素MIC最高,为64μg·mL~(-1)。加入低浓度环丙沙星(1/4 MIC),菌体浓度和细胞活性显著降低,4-CNB降解率下降至87.0%±3.3%,环丙沙星浓度高于最小抑菌浓度(4 MIC)时,菌株生长受到极大抑制,4-CNB降解率仅为35.7%±3.9%。SOD酶活结果显示,加入环丙沙星能显著降低菌体细胞的SOD酶活力,引起活性氧对菌体的损伤,因此环丙沙星导致的菌体细胞内SOD酶活力降低可能是4-CNB生物降解受到抑制的主要原因之一。     

典型超微细菌降解邻苯二甲酸二丁酯的途径及水合酶的表达纯化研究

典型超微细菌菌株PAE-UM属于β-变形菌门丛毛单胞菌属(Curvibacter sp.),是革兰氏阴性菌株,可利用DBP作为唯一碳源。利用流式细胞仪检测细菌生长情况,并采用高效液相色谱测定DBP的浓度,结果显示该菌对DBP的降解率为94%,菌株最大生长速率为0.237 2 h-1。已经完成了该菌株的全基因组测序,Gen Bank登录号为LKCX00000000。通过全基因组数据分析及文献对比发现该菌在降解邻苯二甲酸二丁酯的途径中,4-oxalomesaconate水合酶(OMH)是原儿茶酸间位裂解代谢途径中的关键酶,具有催化4-oxalomesaconate(OMA)降解为4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate(CHA)的能力,该酶是降解邻苯二甲酸酯过程中的关键酶之一,也是芳香化合物降解过程中的重要降解酶。利用蛋白结晶技术及分子生物学手段,对关键酶(OMH)进行分子构建,表达、纯化、结晶的筛选,应用X-ray衍射技术对关键酶的晶体进行衍射,获得晶体的衍射数据,进行关键酶的三维结构解析。Curvibacter sp.PAE-UM菌株中的OMH蛋白在大肠杆菌中得到表达,经多种方法纯化后筛选获得了纯度大于95%的蛋白,并经试剂盒筛选获得高质量的蛋白质晶体。在上海光源同步辐射(SSRF)BL~(-1)9U线站收集数据,通过X射线衍射实验收集到分辨率达到2.00的衍射数据,并使用软件HKL2000进行了数据处理与修正,该OMH的结构解析为2.00。后续将通过该关键酶的三维结构的解析进一步阐明该菌降解PAEs的分子机理。