MSTN RNAi双元表达载体构建及效果试验

为了建立有效抑制MSTN基因表达的方法,本试验利用基因克隆技术构建MSTN RNAi双元表达载体,并利用脂质体介导转染成肌细胞、用SDS-PAGE和Western blottingf法检测蛋白质的表达.试验结果表明,以TA载体为克隆载体,pHANNIBAL为中间载体,可成功构建pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体,将其转染成肌细胞48h后,该双元表达载体可明显抑制成肌细胞MSTN基因的表达.     

水牛抑制素α亚基基因RNAi载体构建与检测

抑制素通过反馈抑制促卵泡素的合成与分泌影响动物的生殖功能,将动物的繁殖力控制在种属特有的水平。为探讨通过抑制素基因沉默提高水牛繁殖力的可行性,本文构建并筛选了水牛抑制素α亚基基因的RNAi载体。根据实验室克隆的水牛INH—α基因序列,设计合成了5对特异性单链siRNA序列,经退火形成双链,连入pSilencer4．1-CMVn60载体。重组质粒经酶切及测序正确后转染水牛卵泡颗粒细胞。48h后,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测不同组转染细胞中INH—α基因的相对表达水平,再选择沉默效率高的载体分别检测转染后24、48、72和96h抑制效率的变化。结果显示,经酶切和烈序验证成功构建pSilencer4．1—145、pSilencer4．1-308、pSilencer4．1-769、pSilencer4．1-1013和pSilencer4．1—1053共5个重组RNAi表达载体,其中pSilencer4．1-308、pSilencer4．1—769、pSilencer4．1—1013和pSilencer4．1-1053具有抑制效果,抑制效率分别为58．8％、44．9％、67．4％和43．9％。选择pSileneer4．1—1013载体转染颗粒细胞24、48、72和96h后的抑制效率分别为27．1％、61．0％、57．0％、41．2％,转染48h后抑制效率最高。本研究成功构建了有效抑制的水牛INH—α基因表达的RNAi载体,为研制INH—α沉默的转基因水牛新品系奠定了基础。     

紫花苜蓿MsCOL1基因RNAi表达载体的构建及转化

根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的两对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建含有发夹结构的RNAi载体pART-S-A.利用农杆菌介导方法,将pART-S-A转化到紫花苜蓿中,经PCR检测,获得了7株转基因植株.经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因表达量有所下降,其中5株的表达量明显的降低.结果表明,已构建成功具有发夹结构的RNAi载体pART-S-A,它可有效的抑制紫花苜蓿MsCOL1基因.     

RNAi及其在家畜繁殖中的应用

双链RNA介导的、序列特异的基因沉默的过程称为RNAi(RNA interference)。它作为新兴的基因阻断技术,具有特异性、高效性,存在放大效应等,为功能基因特异性失活提供了一种有效方法,正成为研究基因功能的重要工具。同时,RNAi还为基因组、基因治疗、药物探察研究提供了有效技术。本文简单介绍了RNAi的发现、特征、作用机制及在家畜繁殖中的应用等方面的研究进展。     

RNAi及其在家畜繁殖中的应用

双链RNA介导的、序列特异的基因沉默的过程称为RNAi（RNAinterference）。它作为新兴的基因阻断技术，具有特异性、高效性，存在放大效应等，为功能基因特异性失活提供了一种有效方法，正成为研究基因功能的重要工具。同时，RNAi还为基因组、基因治疗、药物探察研究提供了有效技术。本文简单介绍了RNAi的发现、特征、作用机制及在家畜繁殖中的应用等方面的研究进展。     

实时荧光定量PCR检测PrP基因在金黄地鼠脑组织的动态表达

金黄地鼠是研究动物传染性海绵状脑病的理想模型动物之一,其脑组织内朊蛋白基因动态表达数据的测定对探讨该类疾病的发生、发展和分子致病机理具有重要意义。我们利用实时荧光定量RT-PCR技术,对不同年龄金黄地鼠大脑、小脑、丘脑和脑干PrP基因的表达进行了定量。结果发现,脑的四个检测部位都呈现高的表达量,但是同一年龄段不同组织每纳克总RNA中朊蛋白基因的表达量和每毫克组织中朊蛋白基因的表达量有显著的差别,不同组织在不同年龄出现表达高峰。本研究的结果对于探讨朊蛋白的基本功能和脑组织在传染性海绵状脑病病理发生中的作用,提供了基础数据。     

人胰岛素基因杆状病毒表达载体的构建及其在Sf9细胞中的表达

对人胰岛素基因真核表达载体（pCMA／mINS）进行Xho I酶切，回收的含人胰岛素基因组基因的1608bp片段与线性化的杆状病载体pFast Bac I进行连接，获得重组载体pFast/mINS。将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌，在体内进行重组，并经2次抗性与蓝白斑筛选，得到杆状病毒重组载体Bacmid/mINS。将该载体转染Sf9细胞，获得了重组杆状病毒，经Tricine-SDS-PAGE和Western-blotting检测，重组杆状病毒在Sf9细胞中的表达产物是胰岛素原，而细胞培养上清中未检测到胰岛素和胰岛素原。     

紫花苜蓿MsZIP基因RNAi表达载体的构建及苜蓿转化

根据已经得到的MsZIP基因序列(GenBank序列号:HQ911778),设计两对含有酶切位点的引物ZIPF1/ZIPF2和ZIPR1/ZIPR2,合成用于构建干扰载体的正反义片段。将正反义片段插入到载体pART27中,构建成为含有发夹结构的RNAi干扰载体pART-F-R。采用农杆菌介导的方法,将该干扰载体成功转化到苜蓿中,得到9株抗性苗,选取其中的3株进行PCR鉴定,结果表明成功得到转基因苜蓿。     

利用RNAi抑制口蹄疫病毒的复制

根据口蹄疫病毒 IRES和 L 串联序列两侧的保守区域设计了 2个引物 ,利用 RT- PCR和 PCR方法扩增出该串联序列 ,并进行了测序。测序结果表明 ,扩增产物与 Gen Bank上相应的序列具有很高的序列同源性 (大于 99% )。在测序的基础上 ,选择了 L 基因上的 1个靶位点 (位于启始密码子下游第 2 2 9nt后 2 1 nt长的序列 ) ,合成了 si RNA表达盒SEC- L2 2 9。细胞单层长成 5 0 %～ 70 %时 ,将纯化的 SEC- L2 2 9转染到 BHK细胞中 ,转染 4 h后用高感染复数 FMDV接种 ,2 4 h后用间接免疫荧光方法对口蹄疫病毒在 BHK细胞中的复制进行检测。研究结果表明 ,SEC- L 2 2 9极大地抑制了口蹄疫病毒在 BHK细胞中的复制 ,且该抑制作用具有序列特异性 ,并降低了 BHK细胞的死亡率。另外 ,2 5 ng和5 0 ng SEC- L2 2 9处理组间对病毒复制的抑制作用差异不明显 ,可能是病毒基因组发生了突变。本试验表明 ,利用 PCR方法合成的 SEC在 BHK细胞中能特异性地抑制 FMDV的复制 ,RNAi技术可能为防治口蹄疫提供一个新的途径     

牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达.提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体.     

RNAi技术的应用

将双链RNA导入细胞内会引起与其同源的基因的沉默，这种现象称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。作者从RNAi技术的历史、作用机制、应用以及前景4个方面，其中主要就其应用方面的研究作一综述。     

RNA干扰抑制猪瘟病毒增殖的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、调控基因表达的监控机制,是存在于真核细胞内的一种自我保护现象。随着对RNA干扰机制的深入理解,其在病毒性疾病上的应用的研究也初显成效。作者概述了RNA干扰的作用机制及抑制猪瘟病毒增殖的研究现状,并提出了存在的问题和研究方向。     

RNA干扰技术的应用研究进展

RNA干扰是指由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)启动的序列特异的转录后基因沉默现象,广泛存在于真菌、植物和动物中。RNA干扰技术是近年来迅速发展起来的高效、特异、易操作的基因阻断技术,在功能基因组的研究中有着广阔的应用前景。文章对RNA干扰的分子机制、生物学功能和RNA扰技术的优势以及其在功能基因组、基因治疗、转基因动物研究、药物开发等方面的应用做一综述。     

RNA干扰及其抗口蹄疫病毒复制的研究进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指由双链RNA（double strand RNA,dsRNA）介导的序列特异性RNA降解作用。已经证明,在植物和昆虫细胞中RNAi是其主要的抗病毒机制,但迄今为止,几乎没有发现哺乳动物细胞感染病毒后能自发诱导有效的抗病毒RNAi反应。为此,通过人工方法在哺乳动物细胞中建立有效的抗病毒RNAi便成了国内外学者孜孜探索的重要抗病毒策略之一。目前,RNAi的分子机制及其功能仍然有待更加深入地研究与阐明,但它作为一种反向遗传学手段已经在基因组结构与功能研究中得到广泛运用,不仅在抗多种哺乳动物病毒的研究方面取得了令人振奋的结果,而且已作为一种治疗策略运用于人类抵抗重大遗传性和病毒性疾病的研究当中。笔者对RNAi的分子机制,及其抗口蹄疫病毒复制的相关研究进展作了有关介绍。     

RNA干扰文库研究进展及其应用

RNA干扰是一种在进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制,存在于许多不同种属的生物体中,在生物体细胞之间进行传递,具有抵抗病毒入侵和维持基因组稳定的作用.RNA干扰文库是以RNA干扰技术为基础建立的一种简单、高效、大规模、高通量的功能基因组学研究的工具,应用于大规模基因功能的筛选,在基因功能研究、发现新的药物靶基因和疾病相关基因等方面具有广阔的应用前景.     

RNA干扰的作用机制及应用前景

RNA干扰是将双链RNA导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程,涉及多种蛋白质共同参与。此干扰机制可在转录、转录后和翻译水平上实现。转录水平上的干扰机制是通过对靶基因染色质结构的改变,使其基因转录受限,导致表达系统的关闭。翻译水平上的干扰机制,是通过抑制相应mRNA的翻译,使相应的蛋白质表达受阻。转录后水平则包括siRNA形成阶段和扩增循环阶段。siRNA形成阶段即外源性或内源性dsRNA通过Argonaute家族基因编码的蛋白质的识别,进一步诱导双链RNA与Dicer结合。扩增循环阶段即特异性siRNA与靶mR-NA结合后,没有被活性酶切割、降解;而是以siRNA中的一条链为引物,以靶mRNA为模板,在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下,延伸形成新的双链RNA,被Dicer内切酶或相关酶切割为新的21 nt~23 nt siRNA。随着RNA干扰技术的不断进步,RNA干扰可广泛地应用到抗病毒,肿瘤治疗,药物靶点筛选以及免疫性疾病治疗等方面。     

RNA干扰及其在动物传染病方面的研究概况

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种沉默靶基因活动的过程,可以实现对特定的mR-NA的选择性降解,进而抑制其翻译过程。论文介绍了RNAi的发现、作用机理、作用特点及其在猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、禽流感、新城疫、狂犬病等动物传染病方面的研究概况。