现代诊断技术在兽医学上的应用及其进展

1　免疫酶技术 (ＥＩＡ)ＥＩＡ是根据抗原 -抗体结合的特异性 ,以酶作标记物 ,酶对底物具高效催化作用的原理而设计 ,既可用于抗原的检查 ,也常用于血清抗体的检测。1 .1　酶联免疫吸附试验 (ＥＬＩＳＡ)ＥＬＩＳＡ是应用最广泛的免疫酶技术 ,包括间接法、夹心法、竞争法等。自ＶＯＬＬＥＲ和ＢＩＤＷＥＬＬ(1 975 )首先报道了应用间接ＥＬＩＳＡ方法检测病毒特异性抗体以来 ,ＥＬＩＳＡ方法已普遍应用于传染病的流行病学普查、抗体水平的评价以及疫苗质量的监控和标化等 ,迄今为止大多数动物病原体均已发展或报道了ＥＬＩＳＡ方法的研究与…     

检测鸡慢性呼吸道病抗体ELISA方法的建立

用败血支原体（ＭＧ）Ａ５９６９株制备ＥＬＩＳＡ抗原,与抗鸡ＩＧ单抗ＩＢ７酶结合物建立了检测鸡血清抗体水平的间接ＥＬＩＳＡ方法,交叉试验、阻断试验、重复性试验等表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高。确立了将鸡血清６４倍稀释监测ＥＬＩＳＡ效价（ＥＴ）的回收方程ｙ＝１．３８３＋０．２２４ｘ,可用于定量测定,血凝抑制试验（ＨＩ）与ＥＬＩＳＡ比较试验表明,ＥＬＩＳＡ法比ＨＩ试验敏感性高４倍以上。     

ELISA双抗体夹心法诊断犬冠状病毒肠炎

从冠状病毒（ＣＣＶ）阳性病犬粪便提取物中提纯抗原，制备豚鼠抗血清，用饱和硫酸铵盐析法粗提，再经ＱＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０离子柱层析，提取ＩｇＧ，以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记，制备酶标抗体，按ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法操作术式，建立检测犬冠状病毒的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法，诊断犬冠状病毒肠炎粪样，并以电镜检查比较，证明该法特异、敏感，可在４小时内报告结果。     

现地马传贫琼扩阴性 酶联免疫法阳性病马血清的特异性试验

在内蒙古牙克石市图里河镇非马传贫注苗区，用琼脂扩散试验（ＩＤ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）两种方法对６４匹马进行了对比检查，检出ＩＤ、ＥＬＩＳＡ双阳性４匹、ＤＬＩＳＡ单阳性马３匹。对３匹ＩＤ阴性，ＥＬＩＳＡ阳性马血清用不同浓度琼扩抗原重复检测结果为阴性，而用不同批次的ＥＬＩＳＡ抗原包被板及酶标抗体检测结果均为陧阳性，用马传盆病毒抗原对３匹单阳性马血清中和后，再进行ＥＬＩＳＡ测定，ＯＤ值均降低５     

检测禽白血病／肉瘤病毒ELISA双抗体法的研究

用差速离心和非线性蔗糖密度梯度离心法提纯了感染雏鸡血浆中禽成髓细胞性白血病病毒（ＡＭＶ），并用ＳＤＳＰＡＧＥ法提取了ＡＭＶ的结构蛋白Ｐ２７％ｇａｇ，以纯化的Ｐ２７＾ｇａｇ高免家兔，制备了兔抗Ｐ２７＾ｇａｇ的禽白血病／肉瘤病毒群特异性抗体。选用兔抗Ｐ２７＾ｇａｇＩｇＧ作为包被抗体。该抗体和辣根过氧化物酶的结合物作为酶标抗体，以聚苯乙烯微量板为固相载体，建立了监测禽白血病的ＥＬＩＳＡ双抗体法，经试验柱     

PPA-ELISA检测猪传染性胸膜肺炎抗体方法的建立

猪传染性胸膜肺炎是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌引起的 ,以急性胸膜肺炎为特征的猪的呼吸道传染病。该病发病率高 ,对养猪业危害极大 ,目前该病的实验室诊断方法主要依靠病原分离鉴定和间接血凝反应检测血清抗体。我们根据葡萄球菌Ａ蛋白 (ＳＰＡ)具有与哺乳动物血清中ＩｇＧＦｃ段结合 ,而与猪ＩｇＧ的亲和力最强的特点 ,将ＳＰＡ与辣根过氧化物酶偶联制备的酶标ＳＰＡ(ＰＰＡ) ,具有酶标第二抗体的性质 ,且应用范围广。依此 ,试图建立起ＰＰＡ酶联免疫吸附测定法 (ＰＰＡ-ＥＬＩＳＡ) ,检测猪传染性胸膜肺炎抗体的检验程序。1　材料与方法…     

抗赭曲霉毒素A酶标抗体的研制与应用研究

采用过碘酸钠氧化法研制成功了兔抗赭曲霉毒素Ａ酶标抗体。通过进行ＥＬＩＳＡ直接试验，对含不同浓度的赭曲霉毒素Ａ纯品和含毒饲料浸提液作了检测。结果证明，用过碘酸钠氧化法制备酶标抗体，方法简便、省时；用ＥＬＩＳＡ直接法检测赭曲霉毒素Ａ，具有灵敏度高，特异性强等优点。     

单抗—ELISA一步法检测兔粪样中的轮状病毒

用单抗２Ｂ４包被ＥＬＩＳＡ微孔反应板，将处理后的粪样和酶标兔抗ＬａＲＶＩｇＧ同时加入包被孔内孵育，置微型振荡器上振摇，建立了检测粪样中兔轮状病毒抗原的单抗－ＥＬＩＳＡ一步法快速诊断技术，与常规ＥＬＩＳＡ，病毒分离培养，电镜，荧光抗体等作了实验室和临床应用比较，结果证明单抗－ＥＬＩＳＡ－一步法第三特异，快速，简便１，适于基层临床推广应用。     

抗鸡传染性法氏囊病病毒酶标抗体的研制与应用

该试验采用过碘酸钠氧化法研制成功了抗鸡传染性法氏囊病病毒酶标抗体。通过进行双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ试验，对不同送检病料中的传染性法氏囊病病毒进行了检测。结果表明：用过碘酸钠氧化法制备酶标抗体方法简便、省时；用双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ试验检测传染性法氏囊病病毒，具有灵敏度高、特异性强等优点。     

禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究

用表达禽流感病毒（ＡＩＶ）核蛋白基因的杆状病毒感染Ｓｆ９昆虫细胞。以其表达产物制备抗原,建立了以杆状病毒系统表达的ＡＩＶ核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ）。其抗原最适包被量为０．６μｇ／孔,等检血清最适稀释度为１：２００,酶标抗体使用浓度为１：１０００。根据对１４０份ＳＰＦ鸡血清检测结果的统计分析,确定其判定标准为ＯＤ均为阴性;检测Ａ型ＡＩＶ１５个不同亚型（Ｈ１￣Ｈ１５）毒株的特异性血清均为阳性;对人工接种ＡＩＶ的ＳＰＦ鸡第３天即能检出抗体,到第１６２天试验结束时检测仍为阳性。其批内和批间重复试验的变异系数分别在２．９％￣７．２％和３．４％￣９．８％之间。对３１３８份鸡血清进行监测,ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ（ＡＩＶ－ＥＬＩＳＡ）、琼脂扩散     

ELISA检测兔巴氏杆菌病抗体的研究

应用ＥＤＴＡ处理和超声波裂解法提取多杀性巴氏杆菌的荚膜多糖和外膜蛋白抗原，包被酶标板，用ＨＲＰ－ＳＰＡ代替酶标抗体，建立了检测兔多杀性巴氏杆菌病抗体的间接法ＥＬＩＳＡ。试验确定抗原的包被浓度为６．０５μｇ／ｍｌ，ＨＲＰ－ＳＰＡ的适宜稀释度为１１００００，血清ＥＬＩＳＡ滴度在１４００以上判为阳性。测定了多杀性巴氏杆菌灭活菌苗免疫兔血清１０份，均呈阳性，抗体滴度在１１２８０～１４０９６０范围内呈正态分布；血清几何平均效价为１５１２０。重复４次测定１０份阳性血清，其ＯＤ值之标准差（ＳＤ）＜０．１０，变异系数（ＣＶ）＜１０．０％。本法与琼脂扩散沉淀试验相比，敏感度提高约１５７５倍。ＥＬＩＳＡ不仅敏感、特异、快速、简便，而且经济、易于重复，适于推广应用。     

检测猪瘟抗体的PPA—ELISA诊断试剂盒的制备,标化和应用的研究

以猪瘟兔化毒接种猪肾细胞（ＰＫ－１５细胞系）,提取细胞培养物进行纯化,以纯化病毒抗原和酶标葡萄球菌Ａ蛋白探索建立了检测猪瘟病毒抗体的ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ方法,其最佳工作条件为：抗原包被浓度为２μｇ／ｍＬ,酶标Ａ蛋白浓度１：３０,底物作用时间３０ｍｉｎ。经对不同血清的检验,本法有较高的特异性和敏感性,同时本试验也证明ＥＬＩＳＡ与ＩＨＡ检测结果具较高相关性。     

单抗-ELISA一步法检测兔粪样中的轮状病毒

用单抗２Ｂ４包被ＥＬＩＳＡ微孔反应板，将处理后的粪样和酶标兔抗ＬａＲＶＩｇＧ同时加入包被孔内孵育，置微型振荡器上振摇，建立了检测粪样中兔轮状病毒（ＬａＲＶ）抗原的单抗－ＥＬＩＳＡ一步法快速诊断技术，与常规ＥＬＳＩＡ、病毒分离培养、电镜、荧光抗体等作了实验室和临床应用比较，结果证明单抗－ＥＬＩＳＡ一步法敏感、特异、快速、简便、适于基层临床推广应用     

ELISA的放大系统

ＥＬＩＳＡ的放大系统杨永钦（云南省畜牧兽医研究所，６５０２２４）ＥＬＩＳＡ广泛用于抗原抗体的分析检测，八十年代以来，研究者从多方面探索了提高ＥＬＩＳＡ敏感性方法，包括选择理想的标记酶［１］，用荧光法检测标记酶的活性［２］，使用高亲和力的抗体及引进放大...     

快速检测鸡新城疫病毒的聚乙二醇单抗夹心ELISA试验的建立和应用

以抗鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）单抗夹心ＥＬＩＳＡ试验为基础，在６０００，建立了ＰＥＧ－ＥＬＩＳＡ法，使用此法检测临诊样品，与单抗夹心ＥＬＩＳＡ相比，时间缩短７０分钟且提高了ＯＤ４９０值，易于识别。结果表明，ＰＥＧ－ＥＬＩＳＡＩ法具有实际应用价值。ＰＥＧ能加强抗原－抗体反应的速率和强度，这种效应在固相夹心ＥＬＩＳＡ第二步表现尤其明显。ＰＥＧ的这种非特异性效应对于检测其它抗原或抗体的ＥＬＩＳＡ试验可能具有     

家兔黄艾美耳球虫血清抗体ELISA检测法的建立

应用制备的孢子化卵囊可溶性抗原作了包被抗原建立了兔球虫血清抗体的ＥＬＩＳＡ检测法。其最适条件为：抗原包被浓度，２００μｇ／ｍＬ；包被温度，３７℃（２ｈ）；血清反应时间，１．５ｈ；酶标抗体标准工作浓度，１：１０００；反应时间，１ｈ待检血清稀释度，１：１００：ＥＬＩＳＡ试验的规定吸收值为０．０６，孢子化卵囊可溶性抗原比非孢子化卵囊可溶性抗源更适于作为ＥＬＩＳＡ包被抗原。     

Ab—ELISA和Ag—ELISA诊断骆驼伊氏锥虫感染的比较

采用四种方法：即①单克隆抗体检抗原的酶联免疫吸附试验（Ａｇ－ＥＬＩＳＡ）②检测抗体的在酶联免疫吸附试验（Ａｂ－ＥＬＩＳＡ）③表膜检查（ＢＣＥ）④小白鼠接种（ＭＩ），检查了肯尼亚１８３头骆驼锥虫的循环抗原，ＢＣＥ查出尼亚１８３头骆驼锥早的循环抗原，ＢＣＥ查出３７头阳性２０％），ＭＩ６０头阳性（３３％），Ａｇ－ＥＬＩＳＡ６３头阳性（４９％），Ａｂ－ＥＬＩＳＡ检出出的２４头中，Ａｇ－ＥＬＩＳＡ检出１８头     

Dot—ELISA检测猪生殖和呼吸综合征抗体的研究

用差速离心法提纯ＰＲＲＳ病毒，利用ＮＣ膜作为载体，在国内外首次成功建立了检测ＰＲＲＳ血清抗体的斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）。抗原包被浓度为１００μｇ／ｍｌ，被检血清工作浓度为１：１０，酶标兔抗猪ＩｇＧ工作浓度为１：６００。对７２份北京地区猪血清分别用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和ＩＦ检测，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测阳性率为３３．３％，ＩＦ检测阳履率为３０．６％，与ＩＦ符合率较高，对部分待检血清检测     

用裂殖体和卵囊抗原检测鸡球虫血清抗体

将柔嫩艾美球虫孢子化卵囊和第二代裂殖体制成可溶性抗原，用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测实验感染性柔嫩艾美球虫肉用鸡和ＳＰＦ单冠白来航蛋鸡的血清抗体。肉鸡于１５日龄接种卵囊，接种后１９天，ＥＬＩＳＡ值迅速增加，接种后２９和３２天，抗裂殖体和卵囊原ＥＬＩＳＡ值均达最高值。抗裂殖体抗原ＥＬＩＳＡ值明显高于抗卵囊抗原ＥＬＩＳＡ值。ＳＰＦ蛋鸡于１５日龄接种孢子化卵囊，接种后７天，ＩＬＩＳＡ值迅速增加，抗     

禽白血病:诊断技术出新

用差速离心机非线性蔗糖密度梯度离心法 ,提纯感染雏鸡血浆中的ＡＭＶ ,用改良的ＳＤＳ -ＰＡＣＥ法 ,提取ＡＭＶ结构蛋白Ｐ２７ ,以纯化的Ｐ２７高免家兔 ,制备出兔抗Ｐ２７群特异性抗体。选用兔抗Ｐ２７ＬｇＧ作为包被抗体及辣根过氧化物酶结合物为酶抗体、建立起监测禽白血病的ＤＡＳ -ＥＬＩＳＡ技术。经多方验证 ,其具有特异性强、敏感性高、重复性好、费用较低等特点。本项目属鸡传染性肿瘤性疾病禽白血病的诊断技术 ,可用于种鸡净化、ＳＰＦ鸡群监测、鸡疫苗质量检验及进出口禽蛋检疫等方面。社会效益显著。本研究在毒种选育的抗原制…