北疆棉区棉花黄萎病菌培养性状及致病力分化

【目的】 研究新疆北疆棉区棉花黄萎病菌的致病类型、培养特性及致病力分化。【方法】 从北疆主要植棉区采集棉花黄萎病病株,利用大丽轮枝菌特异引物VDS-F/VDS-R、落叶型菌系特异性引物D1/D2、非落叶型菌系特异性引物ND1/ND2对所有分离的菌株进行检测;根据落叶型和非落叶型菌株在单个条田中所占的比例对田间地块进行分析;选取18个代表菌株对其在PDA上的培养特性及对棉花的致病力分析。【结果】 从北疆棉田病株上分离到644个大丽轮枝菌菌株,67.5%的菌株为落叶型菌系,27.8%为非落叶型菌系,4.7%菌株不能归类,供试菌株的致病类型存在分化,其中以落叶型菌系为主要致病类型。对田间地块进行分析,单一落叶型菌株发生的地块最多,其次是落叶型和非落叶型菌株混合发生地块,田间以落叶型菌株为优势菌株的地块占70.1%,落叶型菌系为田间地块的主要致病类型。18个代表性菌株形成菌核型、菌丝型和中间型3种菌落类型,菌核型为主要的培养类型,并进一步分化形成3种不同的类型。对棉花感病品种的致病力进行测定,落叶型菌株引起的病指普遍高于非落叶型菌株引起的病指,非落叶型菌株中也有病指很高的菌株,北疆棉花黄萎病菌的致病力存在明显分化。【结论】 北疆棉田采集的棉花黄萎病菌,其致病类型、培养特性及致病力均存在明显分化。     

新疆棉花黄萎病发生调查及病原菌系统进化分析

[目的]调查新疆主要植棉地区棉花黄萎病发生情况,对新疆棉花黄萎病菌系系统进化及落叶型菌系分布进行分析和检测.[方法]抽样调查棉花黄萎病发病情况,利用Verticillium dahliae特异性引物D1/D2进行落叶型检测;利用真菌通用引物ITS1和ITS4对新疆菌系进行扩增,测序后进行BLASTN分析.[结果]棉花黄萎病在新疆主要植棉地区普遍发生,棉花黄萎病发生中度及以上病田占比达48.1;,严重发生病田占比为24.1;;BLASTN分析证实采集的棉花黄萎病菌系均为大丽轮枝菌;供试棉花黄萎病菌系检测出22株落叶型菌系,占供试菌系的37.2;.在分离到棉花黄萎病菌系的15个采集点中有9个点检测到了落叶型菌系,占比为60.0;.[结论]新疆部分棉区棉花黄萎病发生比较严重,强致病力的棉花黄萎病落叶型菌系在新疆呈现逐年增加的趋势,且地理分布较广.     

大丽轮枝菌致病力与寄主棉苗落叶的相关性

以棉花黄萎病菌强致病力菌株Vd084、Vd082和弱致病力菌株Vd001为供试菌株,以耐病品种中棉所35和感病品种冀棉11为鉴别寄主,采用蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液体法,首先明确棉花黄萎病菌致病力与落叶间的关系,然后采用大丽轮枝菌落叶型菌株特异引物D-1/D-2和非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2对供试菌株进行分子检测。结果表明,1×107 mL-1的常规接种量下,3个菌株均能导致棉苗出现落叶;与弱致病力菌株相比,强致病力菌株出现落叶的时间早3d,且落叶株率高。在接种量为1×105~1×107 mL-1,强致病力菌株的落叶株率显著高于弱致病力菌株,当接种量达到1×108 mL-1时,强致病力菌株和弱致病力菌株间差异不明显。3个菌株在耐病品种上的落叶株率(28.8%)显著低于感病品种(37.7%)。分子检测表明,2个强致病力菌株Vd084和Vd082为落叶型菌株,弱致病力菌株Vd001为非落叶型菌株。结果显示,该2对引物检测出的非落叶型菌株Vd001在温室苗期人工接种条件下仍能导致棉苗落叶。可见,对于落叶型棉花黄萎病菌的检测还需要建立更完善的方法,尤其是模拟大田间条件的检测方法更为重要。     

石河子地区棉花黄萎病菌培养特性和致病力分化研究

[目的]明确当前石河子地区棉花黄萎病菌致病力分化的情况,从病原角度入手搞清病害明显加重的原因.[方法]采用鉴别寄主法和分子生物学的方祛,对采自石河子地区的29个黄萎病菌系进行培养特性观察、致病力测定和特异性引物PCR检测,分析不同致病类型菌系的致病力及接种后落叶情况.[结果]各供试菌系的生长速度存在一定差别,其菌落形态主要为菌核型和菌丝型,分别占75.9;和17.2;.鉴别寄主法测定表明,供试菌系存在明显的致病性分化,强、中、弱菌系分别占51.7;、31.0;和17.3;.致病型测定显示,供试菌系中落叶型菌系和非落叶型菌系分别占37.9;和58.6;,1个菌系未检测出致病类型.落叶型菌系的致病性明显强于非落叶型菌系,其平均病情指数分别为39.5和27.6,二者接种后的落叶程度虽有明显差异,但都可以产生落叶症状,其落叶症状的轻重不仅与菌系的致病类型有关,同时与品种的抗病性也密切相关.[结论]石河子地区棉花黄萎病菌的菌落形态主要以菌核型为主.落叶型菌系的致病力明显高于非落叶型菌系,强致病力落叶型菌系的明显增多是当前病害明显加重的原因之一.     

石河子地区棉花黄萎病菌致病型的分子监测

[目的]查明落叶型黄萎病菌在石河子地区的存在情况。[方法]采用了PCR技术对石河子地区棉花黄萎菌系进行检测,监测石河子地区棉花黄萎病菌致病类型。[结果]利用非落叶型棉花黄萎病菌的的特异引物ND1、ND2对石河子棉区采来的114个棉花黄萎病菌菌系进行PCR扩增,108个菌系扩增出1500bp的片段,与文献中报道的非落叶型棉花黄萎菌系扩增出的片段大小一致,说明这些菌系为非落叶型棉花黄萎菌系;而剩余的6个菌系未扩增出任何片段;利用落叶型黄萎病菌的特异性引物D1、D2对这6个菌系进行扩增,也未扩增出任何片段。[结论]非落叶型黄萎病菌占供试菌系的99.5%,表明目前石河子地区棉花黄萎病菌依旧以非落叶型黄萎病菌为主。     

江苏省大丰市棉花黄萎病菌培养特性及致病力分化

对2008年至2009年采自江苏省大丰市植棉区的22个棉花黄萎病菌菌株进行了培养特性及致病力分化方面的研究.依据在PDA培养基上生长时形成微菌核的数量,将菌株分为3种培养类型,其中菌核型占86.4％,菌丝型占9.1％,中间型占4.5％.采用已报道的落叶型与非落叶型的特异性引物对上述菌株进行致病类型的检测发现,落叶型菌株占81.8％,非落叶型菌株仅占18.2％.苗期致病力测定表明大丰市植棉区的棉花黄萎病菌存在明显的致病力分化,甚至在同一田块所分离的菌株也存在致病力的差异分化.     

土壤中落叶型棉花黄萎病菌的分子检测方法

为了建立快速、准确检测土壤中落叶型棉花黄萎病菌的方法,本试验将提取自落叶型棉花黄萎病菌菌株V991的DNA稀释成不同浓度,同时提取在灭菌土中接入不同数量的V991孢子后制成的人工病土中的DNA,并采用五点取样法提取自然土样中的DNA,选用落叶型黄萎病菌的特异性巢式PCR引物,对上述DNA样品进行检测.结果显示:采用巢式...     

新疆棉花黄萎病菌生物学特性及致病性分化研究

[目的]明确新疆主要植棉地区棉花黄萎病菌株的生物学特性及致病力分化情况.[方法]纯化培养采集的菌株,观察其生物学特性;利用鉴别寄主法测定棉花黄萎病菌的致病力.[结果]棉花黄萎病菌菌落形态各异,供试菌系大部分可产生微菌核;供试菌株的最适生长温度为25℃,部分菌株对高温具有一定的耐受性;新疆棉花黄萎病菌可分为强、中、弱3种致病型,其中以中等致病类型为主.[结论]新疆棉区棉花黄萎病菌具有明显的生理分化现象,博乐地区采集的VX27菌株致病力最强.     

陕西棉花黄萎菌落叶型及非落叶型的鉴定

应用落叶型和非落叶型大丽轮枝菌特异性引物D-1/D-2和ND-1/ND-2,对从陕西采集的67株菌株、矿物油室温保藏的24株菌株和中国农业科学院棉花所提供的5个大丽轮枝菌进行落叶型与非落叶型分子鉴定,以明确陕西是否存在落叶型菌株,掌握不同致病类型菌株的出现频率。结果表明,67株陕西菌株中有21株落叶型菌株,46株非落叶型菌株,落叶型菌株的比率为31.3%;其余29株菌株中14株为非落叶型菌株,5株为落叶型菌株,9株未产生特异性条带,1株用两对引物均可扩增出特异性条带。采用无底塑钵菌液浇根法接种冀棉11进行致病性测定,以了解落叶型菌株和非落叶型菌株致病力的差异。结果显示,21株落叶型菌株的平均病情指数为40.5,是19株非落叶型菌株病情指数(17.9)的2.3倍。     

新疆棉花黄萎病菌病原种群监测研究

采用致病性测定、营养亲和群测定及PCR特异性扩增3种方法,对新疆棉区采集的35个棉花黄萎病菌代表性菌系进行致病型鉴定。结果表明,新疆棉花黄萎病菌存在强、中、弱3种不同的致病类型,其中以中等致病类型居多。利用营养亲和群方法将新疆棉花黄萎病菌分为2个亲和群,其中1个亲和群中的所有菌系均与标准落叶型菌系相亲和,另1个亲和群中的所有菌系均与标准非落叶型菌系相亲和。利用棉花黄萎病菌落叶型特异引物进行PCR特异性扩增,有3个菌系扩增出550bp的落叶型黄萎病菌特异性片段。用营养亲和群及PCR特异性扩增均进一步证实目前新疆存在落叶型黄萎病菌菌系。     

新疆棉花黄萎病菌致病性分化监测研究

对新疆棉区采集的35个棉花黄萎病菌代表性菌系进行了生物学特性研究、鉴别寄主法测定及营养亲和群研究.依据鉴别寄主法测定结果,新疆棉花黄萎病菌可分为强、中、弱三种致病型,其中以中等致病类型居多.营养亲和群测定将新疆棉花黄萎病菌分为2个亲合群,其中一个亲合群中的所有菌系均与标准落叶型菌系相亲和,另一亲和群中的所有菌系与标准非落叶型菌系相亲和,从而证实在新疆存在落叶型黄萎菌系.     

棉花黄萎病菌非落叶型与落叶型菌系初步研究

对新疆主要菌系 (非落叶型 )与我国江苏和美国落叶型菌系在病原菌致病力、培养性状、寄主反应型等方面进行研究。结果表明 ,与非落叶型菌系相比 ,棉花黄萎病菌落叶型菌系 (T9和 VD8)主要造成寄主落叶 ,除危害症状存在明显差异外 ,在 PK培养基上 ,落叶型菌系 VD8和 T9菌落生长异常 ,生长初期菌丝分别纠集呈针状、黄色 ,非落叶型菌系在 PK培养基上 ,菌丝生长致密 ,白色。在 PSA培养基上 ,落叶型与非落叶型菌系差异不显著。     

三重PCR检测草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黄萎病菌

【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,25μL的反应体系中含有0.32μmol·L-1C729+/-、0.032μmol·L-1DB19/DB22、0.32μmol·L-1CgInt/ITS4、1.5UTaq聚合酶、0.15mmol·L-1dNTP、1.6mmol·L-1MgCl2。【结论】利用上述引物组合和反应体系进行三重PCR检测,能够快速从田间发病植株和土壤中将草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌和草莓黄萎病菌检测出来,灵敏度可以达到10pg菌丝DNA。     

蛋白激酶A催化亚基VdPKAC1对菌丝型大丽轮枝菌V07DF2培养性状及致病力的调控

【目的】通过同源重组敲除技术,解析菌丝型大丽轮枝菌中蛋白激酶A催化亚基基因VdPKAC1在调控微菌核发育、产孢及其致病力方面的作用。【方法】利用Invitrogen公司的Gateway®技术构建VdPKAC1的同源重组敲除质粒。该质粒的潮霉素抗性基因盒两端分别为靶标基因5′和3′端各1 kb的DNA序列。通过农杆菌AGL-1的介导,将该质粒的T-DNA区域整合到来源于棉花的菌丝型大丽轮枝菌V07DF2菌株中。从6个随机选择的含有潮霉素抗性基因片段的转化子中,通过靶标基因的PCR检测,获得了5个VdPKAC1基因敲除突变体。经过Southern杂交检测,选择了3个敲除突变体材料（2B5、C5和HH2）进行突变表型的观察和分析。在液体PDB培养7 d后观察敲除突变体与野生型菌株的黑色素产生情况;在固体PDA培养28 d后,观察敲除突变体与野生菌株的菌丝生长和休眠结构形成情况。此外,利用棉花根提取物对液体Cazpek-Dox培养7 d的各菌株分别进行诱导处理,在处理24、72 h后分别统计分生孢子数量,以此对敲除突变体和野生菌株的分生孢子产生能力进行评估。最后,将孢子浓度为1×107个/mL的突变体和野生菌株的分生孢子液灌根接种2叶期的棉花,测定其致病力。【结果】Southern杂交结果表明,在上述5个敲除突变体中,只有2B5和C5两个菌株为T-DNA单拷贝插入,而其他菌株均存在T-DNA异位整合的情况。在PDA培养条件下,3个敲除突变体（2B5、C5和HH2）与野生型相比具有黑色素合成增加,气生菌丝更加发达的特点。其中,敲除突变体2B5和C5在平板培养条件下还形成了野生型菌株没有的、与典型微菌核形态不同的深褐色“链状休眠菌丝体结构”。在棉花根提取物的诱导处理下,3个敲除突变体产生的分生孢子数量少于野生型菌株。另外,致病力分析结果表明,敲除突变体材料仍然具有一定的致病力,但却显著弱于野生菌株V07DF2。【结论】在大丽轮枝菌中,通过蛋白激酶A介导的环腺苷酸信号途径控制多种重要性状,而VdPKAC1是这一途径中的重要成员。以前的报道证实,VdPKAC1负调控微菌核的数量,而本研究利用菌丝型菌株V07DF2在PDA培养基上不产生微菌核的这一特性,通过同源重组原理敲除该负调控基因,成功获得可以在PDA上产生休眠结构的菌丝型大丽轮枝菌菌株的突变体。这些突变体材料将为大丽轮枝菌微菌核发育信号途径及其调控基因的发掘提供平台和基础。     

棉花黄萎病菌VdHP1的克隆及功能分析

【目的】明确棉花黄萎病菌（大丽轮枝菌Verticillium dahliae）中一个新基因（VdHP1）的功能,为解析棉花黄萎病菌的致病机制以及棉花黄萎病的防治提供依据。【方法】以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板,对VdHP1全长进行克隆并测序;利用逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分别对棉花根系诱导不同时间VdHP1的表达量及V592菌株不同组织中VdHP1的表达量进行测定;构建针对VdHP1的敲除载体、互补载体和过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化筛选VdHP1基因敲除突变体、互补菌株和过表达菌株;以野生型菌株V592为对照,对VdHP1基因敲除突变体及互补菌株的菌落及菌丝形态进行观察,并对微菌核量、产孢量及致病力进行测定;通过RT-qPCR测定其他致病力相关的基因在VdHP1基因敲除突变体及过表达体菌株中的表达情况。【结果】VdHP1全长为862bp,预测编码蛋白含268个氨基酸,与GenBank中已注释的基因没有任何的序列相似性。野生型菌株V592受棉花根系诱导6—12 h时VdHP1表达水平显著上调,表明VdHP1在大丽轮枝菌侵染早期发挥作用。VdHP1在分生孢子中的表达量显著高于在菌丝和微菌核中的表达量,表明VdHP1在大丽轮枝菌不同组织中的表达具有差异性。与野生型菌株V592相比,VdHP1基因敲除突变体产孢量和产孢梗显著减少,菌丝分支呈螺旋状,对棉花的致病力明显下降。与侵染钉形成相关基因（VdCrz1、VdNoxB、VdPls1）、分泌蛋白释放相关基因（VdSep5）及分生孢子产生相关基因（Vdpf、VdSge1、VGB、VdPLP、VdCYC8、VdNLP1、VdNLP2）在VdHP1基因敲除体中的相对表达量显著下调,在过表达菌株中上调;而与黑色素合成相关基因（VdCmr1、VdSho1、VdLAC、VdPKS1）在VdHP1基因敲除突变体中则显著上调,在过表达菌株中下调。【结论】VdHP1与大丽轮枝菌分生孢子和产孢梗的产生有关,参与大丽轮枝菌致病;VdHP1对与侵染钉形成、分泌蛋白释放及分生孢子产生相关基因的表达具有正调控作用,对黑色素合成相关基因的表达具有负调控作用。     

分离自棉花的轮枝菌“种”的鉴定

【目的】已知引起植物萎蔫病的轮枝菌有5个“种”,本研究旨在澄清在中国引起棉花黄萎病的轮枝菌的“种”类。【方法】从中国12个省84个县分离获得310个轮枝菌菌株,采用生物学性状观察和分子鉴定相结合的方法,对其进行“种”的鉴定。【结果】298株均产生黑色微菌核和轮枝状分生孢子梗,为典型的大丽轮枝菌,另有12个菌株培养性状较为特殊（不产生微菌核,出现黑色菌丝或厚壁孢子）,经温度敏感试验、PCR特异扩增及ITS序列进一步鉴定,2株被确定为变黑轮枝菌,其它10株被确定为大丽轮枝菌,没有出现黑白轮枝菌。【结论】在中国三大棉区,棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌引起的。但在长江流域和黄河流域棉区均分离到1株变黑轮枝菌,其在棉花黄萎病发生过程中的作用及其与大丽轮枝菌的互作还有待进一步研究。