芒果尖孢炭疽病病原菌的绿色荧光蛋白基因标记

芒果炭疽病是世界性的主要病害之一,引起芒果炭疽病的病原菌有胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌2种。通过溶壁酶酶解菌丝体成功制备尖孢炭疽菌原生质体,用抗潮霉素基因作为选择标记,采用PEG介导的原生质体转化法,用绿色荧光蛋白表达载体(pCT74-sGFP)转化原生质体,获得表达GFP尖孢炭疽菌的转化子菌株;转化子菌株在含潮霉素平板上经多次单孢纯化后,在无选择压下连续继代培养仍能发出稳定而强烈的绿色荧光,用GFP特异性引物PCR扩增转化子菌株基因组DNA获得预期大小片段,表明gfp基因已成功导入芒果炭疽病病原菌基因组中,且稳定遗传;GFP标记菌株生长正常,致病性和野生型菌株无明显差别,这为进一步研究该病菌在自然界的生物学及侵染方式奠定了基础。     

几株尖孢镰刀菌的绿色荧光蛋白基因转化

利用PEG介导的原生质体转化方法,将绿色荧光蛋白基因转入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中。结果表明：转化子连续转接5代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入到菌株中,为后续研究香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌的侵染、防治等提供可视化的检测和分析手段。     

橡胶树尖孢炭疽菌分子检测及遗传多态性分析

根据GeneBank中Colletotrichum属的20个种的ITS序列,比较设计出1对引物CAF53/CAR356(CAF53 5’-GGG CAG GGG AAG CCT CTC G-3’;CAR356 5’-AGC GGT GCT TGA GGG TTG-3’);该引物可以扩增出1条303 bp的尖孢炭疽菌特异性DNA条带。并利用ISSR和RAPD分子标记技术对从海南、广东、广西和云南等垦区橡胶树上收集的21个尖孢炭疽菌株进行遗传多态性分析,以杧果上分离的尖孢作为参照菌株进行了聚类分析。结果表明,RAPD的平均遗传相似系数为0.8,ISSR的平均遗传相似系数为0.7,2种分子标记的平均遗传相似系数基本一致,均可揭示尖孢炭疽病菌的遗传多态性;2种分子标记产生的聚类分析结果存在一定差异;ISSR和RAPD类群与菌株的地理来源均不存在相关性。     

农杆菌介导的芒果胶孢炭疽菌遗传转化及致病性缺陷突变体的筛选

构建含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体pCAMBgfp,以其为转化载体用农杆菌EHA105介导的方法对芒果胶孢炭疽菌Cg-8菌株进行遗传转化,以潮霉素抗性和GFP荧光来筛选阳性转化子。然后,通过离体接种芒果叶片和果实观察病斑大小筛选致病性缺陷转化子。结果获得500个阳性转化子,转化效率为平均106个孢子可获得400个左右同时具有潮霉素抗性和GFP荧光的阳性转化子,且其经多次在无潮霉素的培养基上传代后能得到稳定遗传。随机挑选其中13个突变体进行PCR检测,均可扩增出潮霉素基因目的条带,致病性分析从中筛选得到8个致病性减弱或缺失突变体。     

借助ITS序列用GFP标记巴西橡胶树棒孢霉落叶病病原菌

由多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)侵染引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是影响橡胶树产胶量的主要病害之一。为了开展该病原菌在活体叶片中的病理学研究,本实验将绿色荧光蛋白gfp基因表达盒插入了多主棒孢菌经定点突变后的ITS序列中,构建了重组质粒p ITGH,并经PEG介导转化了原生质体,获得了GFP标记的多主棒孢菌转化子,所获得的转化子经过连续7次转接培养后仍能在分生孢子、分生孢子梗、芽管和菌丝中稳定地发出强烈的绿色荧光,其生长特性和致病性与野生菌株无明显差异。     

根癌农杆菌介导的柑桔遗传转化技术

以新会橙、锦橙(Citrus Sinensis Osb．)胚状体以及北碚447锦橙、纽荷尔脐橙(C．SinensisOsb．)田问成年树腋芽为转化起始材料，经含外源抗菌肽基因(Shiva A和Cecropin B)的根癌农杆菌感染后，比较了胚状体在不同培养基中丛芽的诱导频率和卡那霉素(Km)质量浓度对胚状体丛芽生长以及最终转化频率的影响，也对成年树腋芽在不同BA、IAA质量浓度处理、不同创伤部位和是否用石蜡带(Parafilm)包裹创伤口的诱芽和转化率进行了研究。PCR检测和Southern blot分析证明外源抗菌肽基因(Shiva A和Cecropin B)已导入上述4个柑桔品种；离体抑菌试验证明转基因植株叶片提取液对溃疡病菌有一定的抑制作用。建立了一个简便、快捷、通用的柑桔遗传转化体系。     

根癌农杆菌介导花生高效遗传转化体系的优化

本文研究表面活性剂(MES,methyl ester sulfonate)、真空渗入法和二次侵染对提高花生转化效率的影响,建立了一种农杆菌介导的花生快速高效遗传转化体系。该体系以带子叶的胚轴为外植体,在OD600为0.7的菌液中,加入150mg/L的MES,40kPa真空处理10min,共培养3d后进行二次侵染。采用该体系可显著提高遗传转化率,GUS基因阳性表达率最高,达73.3%。     

硝酸银在香蕉遗传转化上的作用

试验以天宝蕉茎尖横切薄片为材料,研究硝酸银在根癌农杆菌介导的香蕉遗传转化中的作用。试验表明,硝酸银对农杆菌菌株LBA4404有较强的抑制作用;在筛选培养基中添加2mg·L^-1硝酸银,褐变乃至死亡的薄片比未添加硝酸银少9．0％,抗性芽分化率增高5％,因此硝酸银对香蕉的遗传转化有促进作用。     

根癌农杆菌农杆菌介导抗菌肽基因转化大豆的研究

为利用抗菌肽基因培育转基因大豆抗病材料,采用根癌农杆菌介导法将抗菌肽基因和绿色荧光蛋白基融合因转入大豆胚尖外植体。结果表明,60mg/L的卡那霉素可以对转化植株进行有效的筛选;在共培养时添加200µmol/L乙酰丁香酮有利于抗菌肽基因的转化;在生根培养基中不添加卡那霉素更有利于转化苗的成活。目的基因特异的PCR检测和绿色荧光蛋白表达分析,发现抗菌肽基因已转入大豆,并得到表达。     

橡胶树高效农杆菌转化体系的建立

在橡胶（Hevea brasiliensis）花药组织培养和胚性愈伤长期继代增殖技术的基础上,分别以巴西橡胶热研7-33—97品种的花药脱分化愈伤组织和经继代增殖的花药胚性愈伤组织为转化受体,进行橡胶农杆菌转化体系比较研究。结果表明：胚性愈伤组织是更适宜的转化受体。     

农杆菌介导将LycB基因转入优良玉米自交系的研究

以优良玉米自交天塔5的幼胚为材料,诱导出Ⅱ型愈伤组织,用带有质粒pCAMBIA2300-LmLycB-Bar根癌农杆菌C58侵染,对培养基和遗传转化因素进行优化;共培养3 d,延迟培养7 d,再转入含PPT的培养基上连续筛选3代,分化获得再生植株。经PCR和RT-PCR检测,确定获得13株阳性植株,HPLC检测转基因玉米叶片总类胡萝卜素含量为174.83μg/(g.FW),比野生型玉米提高了15.82%。     

半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。     

GFP标记的尖孢镰刀菌西瓜专化型侵染西瓜过程观察

将绿色荧光蛋白基因转入西瓜尖孢镰刀菌FON中,并利用荧光共聚焦显微镜观察GFP标记菌株侵染西瓜的过程.结果显示,转化子连续转接4代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入菌株FON中;利用GFP标记菌株在荧光共聚焦显微镜下观察其侵染西瓜苗的过程,发现在1/2 MS培养的西瓜苗中,FON经过48 h侵染即可进入西瓜的根维管束,第3天便进入茎维管束,第4天进入叶维管束(包括叶柄和叶脉);在土壤盆栽条件下,侵染后2d FON进入西瓜的根维管束,第9天进入茎维管束,第11天进入叶维管束.培养基培养与土壤盆栽相比,培养基栽培FON侵染的速度更快.