鳗鲡冠状病毒样病毒的细胞分离与培养

实验选用４种鱼类传代细胞,对首次发现的鳗鲡“狂游病”的病原－鳗鲡冠状病毒样病毒进行了细胞分离与培养。本研究在鲤上皮乳头状瘤细胞中复制了鳗鲡冠状病毒样病毒粒子,并经病毒细胞培养物的电镜负染和超薄切片法检查得到了证实。     

鲤神经球蛋白基因序列与低氧表达分析

为深入了解鲤珠蛋白家族的基因组成和表达模式,及其与低氧适应能力的相关性,本实验通过鲤基因组框架图比对和全长cDNA文库筛查,获得鲤神经球蛋白(neuroglobin,Ngb)基因完整序列,证实鲤不仅具有独特的脑组织特异表达的II型肌红蛋白(myoglobin-2,Mb-2)基因,也具有Ngb珠蛋白基因,实时荧光定量PCR实验显示,该基因在脑组织特异性表达,并呈现出低氧应答特征。基因结构和系统发生分析表明,鱼类Ngb基因高度保守,鲤Ngb蛋白可能与斑马鱼直系同源蛋白具有相似的结构及功能,而与鲤Mb-2存在明显差异。鲤Ngb基因表达量在两个品系间存在显著差异,耐低氧能力强的散鳞镜鲤Ngb基因表达量高于荷包红鲤抗寒品系。研究表明,鲤Ngb基因可能以与Mb-2基因分工协作的方式共同实现脑组织供氧,执行应对低氧胁迫的神经保护功能,在鲤低氧适应中具有重要作用。     

应用RNAi技术构建的转基因鲤的检测分析

将构建携带H1启动子的肌肉生长抑制基因的真核表达载体,通过显微注射技术导入鲤受精卵核区附近,获得了一批具有RNAi表型的转基因鲤,PCR和分子杂交检测证实外源基因整合到受体鱼的基因组中,阳性率为32.78%;一龄鱼的生长实验表明,转基因鲤比普通鲤平均生长快0.99倍,其体高和体厚分别平均增长0.22和0.26倍,其中有31.82%的群体平均体厚是普通鲤的1.6倍。结果显示,该质粒表达的发夹环型dsRNA可以有效降解其转录产物,对阻抑肌细胞中同源基因的表达、鲤肌肉的再生能力增强起到了重要作用。这种抑制作用表现为鲤背部肌肉增厚、体质量增加,说明该基因经转录产生的双链RNA在鲤体内具有RNAi效应。RNAi技术为获得具有特殊功能的转基因鲤提供了新的手段。     

中华鳖皮肤溃烂病的病原研究

从病鳖肝脏,颈,腿部皮肤溃烂处分离得到菌株ｍ－３,ｍ－６,Ｊ－８,Ｊ－１０株细菌,经人工感染试验证明这四株菌为鳖皮肤溃烂病的病原菌,对菌体形特征,培养特性和生理化反应的鉴定证明了Ｊ－８,Ｊ－１０,为温和气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｏｂｉｒａ）Ｍ－３,Ｍ－６Ｏ为摩根氏菌（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａｍｏｒｇａｎｉｉ）。     

铜离子对转基因和非转基因红鲤行为的影响

在构建转基因红鲤的基础上,采用生物预警系统比较和分析了非转基因和转基因红鲤(Cyprinus carpio)在不同铜离子浓度条件下的游速和活动范围的变化。转基因红鲤和非转基因红鲤孵育自同一批受精卵,转基因红鲤体长(5.31±0.64)cm、体重(3.40±0.55)g,非转基因红鲤体长(4.58±0.59)cm、体重(2.40±0.58)g。CuSO4的浓度设置0(对照)、5、15、25、35和45μg/L共6组。生物预警系统包括储水池、数字摄像仪和数据运算处理器,可以记录鱼的二维移动轨迹,并计算出鱼的平均游速。试验结果表明,非转基因和转基因红鲤的平均游速分别为:对照组1、1.57 BL/s,5μg/L组1.24、1.07 BL/s,15μg/L组1.61、1.03 BL/s,25μg/L组1.50、1.59 BL/s,35μg/L组1.62、1.61 BL/s,45μg/L组1.25、1.97BL/s。非转基因和转基因红鲤的活动范围:除35μg/L组外,其他组的坐标X值非转基因与转基因红鲤间差异都极显著(P<0.01);对照组、5和25μg/L浓度组,转基因红鲤坐标X值极显著高于非转基因红鲤;15和45μg/L浓度组,非转基因红鲤坐标X值极显著高于转基因红鲤。低于45μg/L时,铜离子没有对转基因和非转基因红鲤产生明显的毒性;在45μg/L浓度组,转基因红鲤对铜离子不敏感,而非转基因红鲤较敏感。     

鲤鱼细菌性鳔炎病的流行特点及防治方法

<正>鲤鱼鳔炎病是近几年北方池塘养殖鲤鱼的常见病,与弹状病毒引起的鲤春病毒血症(以前曾经称为"鲤鱼鳔炎症")不同,目前发生的鲤鱼鳔炎病由细菌引起,内服抗菌药物的治疗方法有效果;发病水温也不是鲤春病毒血症的低温期发病,而是在养殖季节温度越高的时候越严重,尤其是25℃以上死亡率高;临床症状也没有病毒病的体表严重出血、突眼的特征性症状,而是以鳔壁溃烂、水肿为主。因此目前鲤鱼养殖者和鱼病防治人员习惯上称其为鲤鱼细菌性鳔炎     

鲤疱疹病毒3型ORF148 DNA疫苗对建鲤鱼苗的免疫保护

鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV),是一种高传染性、致死性病毒。为开发新型CyHV-3 DNA疫苗,前期研究中将CyHV-3 ORF148基因插入pEGFP-N1构建重组质粒,在此基础上,本研究通过转染试验、间接免疫荧光试验证实pORF148-EGFP融合蛋白可以在CCB-J细胞系和建鲤体内表达;将重组质粒作为DNA疫苗,肌肉注射免疫建鲤鱼苗,ELISA检测表明免疫pEGFP-ORF148重组质粒可以显著提高建鲤血清特异性抗体水平; RT-qPCR检测显示,免疫pEGFP-ORF148重组质粒后,建鲤脾脏和头肾中的免疫相关基因如IFN-a1、Mx-1、CXCa、CXCR1、TNF-α、IL-1β及IgM基因表达量均显著提高。攻毒实验显示, CyHV-3攻毒21 d后, PBS组、pEGFP-N1组和pEGFP-ORF148组的建鲤存活率分别为30%、35%和85%,免疫pEGFP-ORF148可以显著提高建鲤的存活率(P0.01)。本研究旨在为CyHV-3 DNA疫苗的应用提供理论依据。     

水库网箱养鲤越冬技术研究

水温２０℃时将越冬鲤放入越冬网箱,继续投饵。根据越简装期间水库撤水量,水温５－０７℃时将网箱平衡地沉入水下一定深度。越冬鲤密度为：鱼种６０－１２０ｋｇ／ｍ％＾２,成鱼１２０－２００ｋｇ／ｍ＾２。     

不同剂量的利血平,多巴胺与LHRH—A促进泥鳅排卵的比较研究

实验结果表明，ＬＨＲＨ－Ａ诱导泥鳅排卵的最佳剂量为０．１μｇ／ｇ体重；利血平４μｇ＋ＬＨＲＨ－Ａ０．１μＧ／Ｇ体重与多巴胺４μｇ＋ＬＨＲＨ－Ａ０．１μｇ／ｇ理为最佳剂量。     

鲤免疫应答相关基因的克隆与鉴定

为研究鲤(Cyprinus carpio L.)白细胞免疫应答相关的分子机理,以体外培养的鲤外周血白细胞为实验材料,用荧光标记的mRNA差异显示(FluoroDDRT-PCR)技术,研究丝裂原(50μg/mL LPS、50μg/mL PHA和50μg/mL ConA)在刺激白细胞4、12和24 h内诱导白细胞免疫应答相关基因的mRNA表达差异,共获得92个差异片段,其中87个片段有再扩增产物,再扩增率为94.6%;将差异片段克隆,经PCR鉴定,获得81个阳性克隆,鉴定率为93.1%;差异片段序列同源性功能分析结果表明,本研究共获得3个免疫应答相关的cDNA克隆,它们分别编码鲤的蛋白酶体激活因子PA28α亚基、翻译延伸因子(EF-1α)和基质金属蛋白酶13(Mmp13)部分序列,为进一步研究这些差异表达基因在鱼类免疫中的作用机制奠定了基础。     

鲤肠粘液与血清中免疫球蛋白的比较研究

鱼类肠道中存在大量粘液,而其中所含的免疫球蛋白无疑对体内以血清ＩｇＭ为中心的免疫系统是一个补充,在鱼类免疫中起着重要的作用。目前人们已从多种鱼类的肠粘液中分离提取了免疫球蛋白［１,２］,但至今未见对鲤肠粘液中免疫球蛋白研究的报道。由于鲤是我国的主要淡水养殖鱼类之一,对其肠粘液与血清中免疫球蛋白进行比较研究,不仅有助于全面了解鱼类的特异性体液免疫机制,而且将会对鱼类病害口服疫苗的免疫防治提供重要理论依据。收稿日期：１９９８－０７－２７１　材料与方法１．１　实验材料鲤２０尾,每尾重约０．５ｋｇ,取自…     

养殖鱼鲤蠢目绦虫防治案例分析

正一、鱼类鲤蠢目绦虫概况1.鱼类鲤蠢目绦虫简介鲤蠢目绦虫隶属于扁形动物门绦虫纲,是全球淡水鱼肠道内都会寄生的一种蠕虫。已有报道证实,最初的绦虫种属关系研究是以鲤蠢目绦虫为探索对象。目前为止,国内发现的鲤蠢目绦虫大都分布在我国东北、中部及东南地区,其中包括黑龙江、长江流域以及台湾海峡水域等,而在我国的西北地区特别是新疆关于鲤蠢目绦虫的研究报道较少。     

红鲤4群体间红细胞免疫功能及其差异

应用红细胞C3b受体花环试验和红细胞天然免疫粘附肿瘤细胞花环试验方法，证实兴国红鲤(Cyprinuscarpio.var.singguonensis)、玻璃红鲤(C.carpio.var.wananensis)、荷包红鲤(C.carpio.var.wananensis)及瓯江彩鲤(C.carpio.var.color)的红细胞表面都存在C3b补体受体，均可形成花环；红鲤的红细胞免疫粘附能力存在着种群间差异，上述2种花环试验的花环率大小的顺序均是：兴国红鲤＞荷包红鲤＞瓯江彩鲤＞玻璃红鲤，差异都极显著(P＜0．01)；4群体红鲤的红细胞均具有吞噬作用。结果证实，鱼类红细胞免疫功能在机体防御病原的过程中占有重要地位。     

三种鲤对暴发性鱼病抗病力的差异

本文报道三种鲤对嗜水气单胞菌引起暴发性鱼病的抗病力试验结果。当菌液浓度为６．０×１０￣８ＣＦＵ／ｍｌ，采用１０￣０、１０￣（－１）、１０￣（－２）、１０￣（－３）四个稀释度、０．３ｍｌ／尾注射剂量时，建鲤、野鲤和镜鲤的半数致死量（ＬＤ＿（５０））分别为１０￣（－１．３７５）、１０￣（－０．９７６）、１０￣（－０．５６２）。这三种鲤的半数致死量差异显著（Ｆ＞Ｆ＿（０．０５））。从四个方面研究了抗病机理：白细胞吞噬功能和补体替代途径（Ｃ＿３旁路）杀菌能力，镜鲤较强于野鲤和建鲤，但无显著差异（Ｆ＜Ｆ０．０５）；红细胞Ｃ＿（３ｂ）受体花环率和补体总量（单位／ｍｌ），是建鲤＞野鲤＞镜鲤，差异极显著（Ｆ＞Ｆ０．０１）。本研究结果还表明建鲤的红细胞Ｃ＿（３ｂ）受体花环率和补体总量稍高，但对暴发性鱼病病原（嗜水气单胞菌）较易感染。以上结果证明，不同品系鲤鱼对暴发性鱼病有种内特异性。     

鲤脑垂体,多巴胺,地欧酮催产青鱼比较

鲤脑垂体加ＬＲＨ－Ａ２催产青鱼，效果稳定，受精率７３－９６％。ＤＯＭ加ＬＲＨ＿Ａ２可以代替鲤垂体，受精率６３－７１％。多巴胺则是使青鱼致死。     

辛基酚对鲤的雌激素效应

研究了辛基酚对鲤的雌激素效应。经10、50、100、300和500μg/L辛基酚暴露32d后,鲤存活率和肥满度与对照组无差异;性腺指数变化明显,雌鱼性腺指数随暴露剂量的增大而增大,雄鱼性腺指数随暴露剂量的增大而减小;50μg/L及以上暴露组与对照组差异显著(P<0.05)。辛基酚能诱导鲤雄鱼产生卵黄蛋白原,暴露剂量为10μg/L组有部分雄鱼肝脏匀浆和血液中检出卵黄蛋白原,50、100和300μg/L组卵黄蛋白原含量随辛基酚浓度的增大而显著增大,500μg/L组卵黄蛋白原含量低于300μg/L组、高于100μg/L组,均为极显著差异(P<0.01)。     

鲤、团头鲂精子生理生态特性的研究──Ⅲ．单糖和渗透压对精子活力的影响

作者观察了鲤、团头鲂精子在０（去离子水）－３００毫渗渗透压的Ｄ－半乳糖，Ｄ－葡萄糖和Ｄ－果糖溶液中的活动情况。结果表明，在这三种单糖溶液里，鲤、团头鲂精子活动的变化规律是一致的。精子快速运动和寿命的时间是以在Ｄ－半乳糖溶液中为最长。这两种鱼精子对这三种单糖的吸收、利用存在差别。     

鲤在阿维菌素胁迫下肝胰腺组织的转录组分析

为了探究阿维菌素胁迫对鲤机体的响应机制,在水温(22±2.0)℃,将体质量(150±30)g的鲤(Cyprinus carpio)分别暴露在阿维菌素浓度0μg·L^-1(对照组)、1.5μg·L^-1和3.0μg·L^-1下5 d,采用转录组学测序分析方法,探究阿维菌素胁迫对鲤肝胰腺转录组学的影响,解析其对鲤的分子毒理机制。通过对所得基因的功能注释发现,被注释的差异基因主要与结合、催化和代谢等功能有关。KEGG通路富集分析结果显示,差异表达基因在药物代谢-细胞色素P450、药物代谢-其他酶、淀粉和蔗糖代谢等通路中显著富集,涉及药物代谢、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢以及辅助因子和维生素的代谢等多个代谢过程。这些功能基因和预测通路为理解阿维菌素胁迫鲤体内解毒和免疫系统奠定了基础。本研究获得的转录组数据可为深入研究鱼类应对杀虫剂污染物的分子机制提供丰富的基因资源。     

基于环境DNA的岩原鲤检测及生物量评估

为建立岩原鲤基于环境DNA （eDNA）的实时荧光定量PCR （qPCR）检测方法,准确鉴别岩原鲤并探讨e DNA浓度与其生物量的定量关系,实验根据岩原鲤mtDNA中12S rRNA基因序列设计eDNA引物和TaqMan探针,利用PCR扩增出岩原鲤12S rRNA基因的序列,克隆入pMD19-T载体,构建重组质粒作为qPCR标准;使用梯度稀释质粒标准品作为模板,进行qPCR扩增,制作标准曲线,建立岩原鲤qPCR检测方法,并评价其特异性、灵敏性和应用效果。结果显示,引物和TaqMan探针对供试的岩原鲤样品出现荧光增长曲线,显示阳性扩增,而其他鱼类和空白对照均未得到扩增信号,表现为阴性;qPCR的阈值循环数（C_t）与标准品拷贝数的线性关系好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数（R²）达到0.999,检测限位DNA浓度为5×10^-6 ng/μL,扩增效率为94.7%;检测养殖不同数量岩原鲤的水体中eDNA浓度,目标DNA浓度和岩原鲤数量存在线性正相关性（R²=0.957）,得到岩原鲤DNA浓度与其个体数...     

一种免疫诱导型鲤启动子的克隆与功能分析

为发掘适用于基因工程抗病育种的鱼类启动子,通过实时荧光定量PCR实验对鲤Rab GTP酶(Ras-associated binding-GTPases 1a3,Rab1a3)基因的表达模式进行了分析,证实该基因在鳃、头肾等与机体免疫防御功能密切相关的组织内转录水平较高,且免疫激活后转录显著增强,符合基因工程抗病育种所需的外源免疫基因转录模式。从鲤细菌人工染色体文库中,使用Rab1a3基因特异引物筛选获得包含该基因区域的文库克隆,测序获得该基因完整序列,以及上下游调控序列。通过生物信息学手段,预测到长度为1014 bp的鲤Rab1a3基因启动子序列,该启动子不具有典型的TATA盒或CpG岛特征,存在多个免疫相关转录因子结合位点。在草鱼肾组织细胞系内验证该启动子活性,结果显示,绿色荧光蛋白基因和萤火虫荧光素酶基因都能够在该启动子驱动下表达,证实该片段具有启动子活性,且启动子活性在受到免疫诱导后增强,双荧光素酶报告基因检测结果显示,该启动子活性在免疫刺激后增强至免疫刺激前的8.67倍。研究表明,鲤Rab1a3基因启动子有望被开发成为免疫诱导型的基因工程元件,驱动外源免疫基因在鱼体内适时表达,抵御外界病原感染,同时避免非必要条件下的过度表达形成生长负担。