鸡柔嫩艾美耳球虫免疫保护性研究

鸡的球虫病是危害现代化养鸡业的重大疫病。柔嫩艾美耳球虫(E．tenella)是球虫病爆发中致病性最强的虫种之一，它由Tyzzer于1927年命名为Eimeria tenella的。它具有严格的寄生部位，主要在鸡的盲肠，通过裂殖体在盲肠上皮细胞中大量繁殖，破坏肠粘膜，引发肠管发炎和上皮细胞崩解，鸡表现为排血便，严重的导致死亡。年龄在10～40日龄左右的雏鸡最容易感染，受害严重，死亡率可达80％以     

不同地理株鸡柔嫩艾美耳球虫致病性的研究

采用盲肠病变记分、每克粪便含有的卵囊数、粪便记分、肉鸡增重等检查方法对来自山东、吉林、黑龙江、北京4个不同地区的鸡柔嫩艾美耳球虫的致病性进行了研究。将上述各株球虫分别接种10日龄AA肉鸡，并于接种后5d开始进行各项指标的检测。结果表明：山东株(S株)的致病性最强，黑龙江株(H株)和吉林株(J株)的致病性次之，北京株(B株)最弱。     

应用RAPD技术对鸡柔嫩艾美耳球虫不同地理株的多态性研究

利用RAPD技术对鸡柔嫩艾美耳球虫(E．tenella)GZ株、HB株、JL株及HB株与JL株杂交虫株FZ1进行了研究。结果表明：E．tenella不同地理株间及同一地理株亲代与子代间均存在DNA多态性。其中不同地理株间种内变异程度较大(SI=O．6225--O.6977)。而同一地理株子代与亲代间也发生遗传变异，但变异程度不大(SI=O.9813--0．991O)。同时对本室培育的HB株与儿株的杂交虫株FZl的基因组DNA进行RAPD分析。发现该杂交株与其亲本HB株、JL株的相似值为O.8215，O.7916，大于HB株与JL株间相似值(O．6977)。小于传代虫株间的相似值(O.9813--O.991O)，且其扩增务带显示出与亲本株间的相似，且又有不同，表明试杂交虫株是1株既具有两亲本株的遗传性状，又发生了变异的虫株。     

不同地理株柔嫩艾美耳球虫卵囊排出量的比较研究

试验采用来自吉林省怀德县、伊通县头道乡和伊通县大虎山等地的柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊,以每只鸡5000,1×104,1×105个的剂量,口服接种7日龄和14日龄无球虫AA肉鸡,对感染后6~13 d每日24 h内所排出的卵囊计数,并对其进行统计分析。结果表明:7日龄雏鸡接种剂量为5000,1×104个时伊通大虎山株的排卵囊量最多,接种剂量为1×105个时怀德株的排卵囊量最多。14日龄雏鸡接种剂量为5000,1×104个时伊通大虎山株的排卵囊量最多,接种剂量为1×105个时怀德株的排卵囊量最多。结果还显示无论接种剂量相同与否,各虫株均从接种后第6 d开始排卵囊,第7 d达到高峰,第8,9 d开始减少,至第13 d趋于0。     

雏鸡免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株和毒株的细胞免疫反应

AA肉鸡雏鸡分别经口免疫柔嫩艾美耳球虫毒株早熟株，用免疫组化ABC法染色检测小肠、盲肠扁桃体、脾脏中CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞动态变化；用淋巴细胞转化实验MTT法检测T淋巴细胞活性。结果表明：球虫免疫鸡后，CD4^ T淋巴细胞在一次免疫后迅速增殖，第6天达到第一峰，免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡盲肠与脾脏中CD4^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到38％和44％，免疫早熟株的鸡盲肠与脾脏中CD4^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到36％和43％，而二次免疫后和对照相比很少有显著差异。CD8^ T淋巴细胞在一次免疫后比CD4^ T增殖速度慢，第9天达到第一峰。免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到37％和47％，免疫早熟株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到36％和48％，二次免疫后迅速大量增殖，免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在二免后第2天盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到39％和50％．免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株的鸡在二免后第2天盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到37％和50％。且CD8^ T淋巴细胞总体水平比CD4^ T淋巴细胞多。盲肠扁桃体中T细胞的增殖速度比其他组织更快。免疫早熟株的鸡与免疫毒株的鸡肠道黏膜中的CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞变化基本一致。一次免疫鸡比未免疫对照T淋巴细胞活性显著升高；进行二免的鸡免疫后第一、二、三周T淋巴细胞活性均比未进行二免的鸡显著升高；毒株免疫鸡T淋巴细胞活性大多与早熟株免疫鸡无8显著差异。     

杨凌地区柔嫩艾美耳球虫早熟株对雏鸡免疫效果的研究

用杨凌地区鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株分别免疫鸡,对免疫前后鸡体的平均增重、饲料转化率、盲肠病变记分和卵囊抑制率等指标进行了分析。结果发现,早熟株免疫组对球虫再攻击时的卵囊减少率分别为77.3%和67.6%,高于母株免疫组的41.7%和57.1%,且对同种同株球虫攻虫时的保护力优于同种不同株球虫。经2次免疫后,早熟株免疫组的鸡平均增重、饲料转化率均高于母株免疫组和对照组,而盲肠病变记分小于后者;早熟株免疫组经球虫攻击后卵囊的繁殖量明显减少,且卵囊抑制率均在91%以上。     

柔嫩艾美耳球虫长春株的抗药性试验研究

对柔嫩艾美耳球虫长春株的抗药性进行试验研究。用最适抗球虫活性百分率、病变记分减少率、相对卵囊产量和抗球虫指数4项指标进行综合判定,观察柔嫩艾美耳球虫长春分离株对氯苯胍、克球粉、地克珠利、马杜拉霉素、氨丙啉、盐霉素、莫能菌素和常山酮的抗药性。表明:柔嫩艾美耳球虫长春分离株对地克珠利和马杜拉霉素敏感,对莫能菌素轻度耐药,对克球粉和常山酮中度耐药,对氯苯胍、氨丙啉和盐霉素重度耐药。本地区防治柔嫩艾美耳球虫可合理使用地克珠利、马杜拉霉素和莫能菌素,对克球粉、常山酮慎用,氯苯胍、氨丙啉和盐霉素暂停使用。     

鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株的分离与鉴定

[目的]鉴定鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株。[方法]采用单卵囊分离技术从西宁当地鸡粪便中获得1株纯种球虫,经鸡体传代增殖,对该虫体的寄生部位、潜伏期、孢子化时间、形态结构等指标进行观察和测定。[结果]该虫株寄生于鸡的盲肠,卵形指数为1．22,最短孢子化时间为18h,潜伏期为114h。卵囊为卵圆形,卵囊壁光滑,呈黄绿色,孢子化卵囊未见卵膜孔和卵囊残体;孢子化卵囊平均为20．08μm×16．55μm。孢子囊纺锤形,有一斯氏体,其平均大小为8．65μm×4．90μm。综合鉴定该球虫为柔嫩艾美耳球虫,并暂命名为柔嫩史美耳球虫西宁株。[结论]该研究为进一步研究球虫的致病性和药物效应奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株SO7基因的克隆表达与保护性试验

【目的】克隆鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因并进行原核表达,检测表达产物的免疫原性,为鸡球虫基因疫苗的制备奠定基础。【方法】以纯化的柔嫩艾美耳球虫杨凌(Eimeria tenella YL)株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E.tenella YL株的SO7基因,对其测序后进行序列分析。将SO7基因克隆到表达载体pET-32a中,构建pET-SO7重组质粒,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达出重组蛋白,将重组蛋白纯化后免疫雏鸡,评价其免疫效果。【结果】鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因序列的开放阅读框(ORF)为651个碱基,共编码217个氨基酸。E.tenella YL株SO7基因与E.tenella LS18株、E.tenella BJ株、E.tenella GD株SO7基因ORF区序列相似性分别为99.1%,98.6%和99.1%,其氨基酸序列相似性分别为99.1%,98.6%和99.1%。SDS-PAGE分析表明,表达产物成功地表达出了分子质量为45ku的融合蛋白。各种抗球虫指标的测定结果显示,该蛋白对球虫感染鸡体具有一定的保护性。【结论】SO7基因具有很强的保守性,各虫株之间差异不大;重组蛋白具有一定的保护效果,适合用来制备基因疫苗。     

对柔嫩艾美耳球虫敏感株与抗药株ATP酶活性的检测

采用ATP酶试剂盒对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)11种敏感株与抗药株的4种ATP酶活性进行了检测。结果表明,鸡球虫不仅具有活跃的ATP酶系统,而且其活性因球虫对药物敏感性的不同而表现强弱不同。敏感株的ATP酶活性最强,而各抗药株的ATP酶活性均有不同程度的降低,尤其是氯化锂(Na -K -ATP酶抑制剂)和利多卡因(Na 通道阻断剂)参与诱导产生的马杜霉素诱导抗药株和盐霉素诱导抗药株的Na -K -ATP酶,Mg2 -ATP酶,Ca2 -ATP酶和Ca2 -Mg2 -ATP酶的活性极显著低于相同来源的抗药株和敏感株的活性。本文研究表明,虫株对药物的敏感性可能与ATP酶活性有关,检测ATP酶活性可作为判别柔嫩艾美耳球虫对离子载体类抗球虫药物敏感性或抗药性的指标之一。     

柔嫩艾美尔球虫库尔勒株免疫原性初步研究

本实验采用单卵囊分离技术,得到1株柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella),对该株E.tenella的免疫原性做了初步研究,分别用100个卵囊/只,1,000个卵囊/只,10,000个卵囊/只的剂量免疫,以100,000个卵囊/只的剂量攻毒,结果显示,1000个卵囊/只的剂量免疫效果最好。     

柔嫩艾美耳球虫杂交株MIC2基因克隆及序列分析

根据柔嫩艾美耳球虫子孢子微线蛋白2的cDNA序列,利用计算机设计l对引物,以柔嫩艾美耳球虫杂交株子孢子总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出1个片段。把这个片段克隆到pMD18-T载体,经酶切鉴定得到1个阳性克隆,测序及序列分析结果表明该片段为MIC2基因,开发阅读框（0RF）与E．tenella豪顿株MIC2核苷酸同源性为99.51％,推导的氨基酸序列同源性为99.12％,说明MIC2基因高度保守。     

化学致弱柔嫩艾美耳球虫杂交F2株免疫性能研究

采用化学致弱剂致弱柔嫩艾美耳球虫杂交F2株卵囊.将致弱的卵囊分别饲喂3组7日龄从肉仔鸡进行免疫,免疫剂量分别为4×103,8 × 103,16×103个/只.首免7日龄,二免14日龄,二免剂量与首免相同.二免后第7 d用吉林野毒株卵囊进行攻虫,剂量为5 × 104个/只.攻虫后第7 d以存活率、相对增重率、病变值、抗球虫指数(ACI)、卵囊值、粪便计分等指标测定化学致弱剂致弱卵囊后免疫性能.结果表明:采用化学致弱剂致弱杂交F2株卵囊后的免疫效果明显高于非致弱免疫组和对照组,尤其免疫剂量为8×103个/只时致弱杂交F2株卵囊免疫效果最佳.     

表面活性素体外抗球虫作用研究

[目的]探讨表面活性素体外抗鸡柔嫩艾美耳球虫的效果。[方法]实验前将柔嫩艾美耳球虫活化,配成2.5×106/ml细胞悬液加入细胞培养板,实验组各孔分别加入不同浓度表面活性素,对照组加入等量MEM,采用定量法作柔嫩艾美耳球虫生长曲线,观察其增长速率。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,观察表面活性素对柔嫩艾美耳球虫成活率的影响,用乳酸脱氢酶(LDH)测定法测定表面活性素对柔嫩艾美耳球虫的损伤。[结果]在5 mg/ml表面活性素作用下其20~120 h增殖率为0,5 mg/ml表面活性素可使其破裂。[结论]表面活性素具有较强的抗柔嫩艾美耳球虫作用,有可能成为预防的理想药物。     

柔嫩艾美耳球虫抗马杜拉霉素、地克珠利虫株特异消减文库的构建

 以遗传背景一致的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株孢子化卵囊为驱动组，马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊为试验组，利用抑制消减杂交（SSH）方法，通过两轮杂交和两次PCR分别构建了富含两个抗药株孢子化卵囊与敏感株孢子化卵囊之间差异表达基因的消减cDNA文库。随机从两个消减文库中分别挑取50个克隆，经PCR鉴定马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊的消减文库重组率分别为96%和98%，差异基因片段大小分布在250 bp～1.0 kb之间。从每个文库中随机挑取65个阳性克隆经斑点杂交试验，分别选择表达量上调的6个克隆进行序列分析和同源性比较。结果发现，有4个cDNA片段可能是新基因片段，与地克珠利抗药株的产生有关；有3个新的cDNA片段可能与马杜拉霉素抗药株的产生有关。这些结果将为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生及发展的分子机理奠定了一定的基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫病流行病学研究进展

从球虫的感染、拥挤效应、营养学因素、宿主免疫力、应激因素、抗球虫药以及与其他疾病混合感染等几个方面 ,概述了影响鸡柔嫩艾美耳球虫病发生和流行的各种因素 ,旨在为球虫病的防治提供科学依据。     

鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离技术的建立

以玻璃纸做材料,用单卵囊分离技术,对柔嫩艾美耳球虫进行了分离,实验室单卵囊感染26只鸡,在感染后5～12d,用饱和盐水漂浮集卵法进行检测,其中10只鸡检出卵囊,结果表明,该单卵囊分离技术简单易行,单卵囊感染成功率达38%,单卵囊技术的关键步骤为:(1)滴管拉的尽量细,(2)滴液尽量小,(3)要耐心观察,(4)实验鸡在0～7日龄。