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转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株的筛选 总被引:1,自引:0,他引:1
为了筛选转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株,本研究参照GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)设计并人工合成拟蜘蛛基因四聚体(4S),与pcDNA3.1载体(K2.10启动子)相连构建真核表达载体(pcDNA3.1-K2.10-4S),采用脂质体介导法转染绵羊成纤维细胞,通过药物筛选、阳性细胞鉴定及体外培养等方法,获得了转蜘蛛拖丝蛋白基因的绵羊成纤维细胞株.结果,用pcDNA3.1-K2.10-4S表达载体转染冷冻复苏的绵羊成纤维细胞后,利用G418筛选法获得neo基因的抗性细胞,即阳性细胞;采用PCR方法对阳性细胞鉴定显示,所构建的载体整合到了细胞基凶组中;对阳性细胞的染色体核型分析显示,阳性细胞核型稳定,与正常细胞的核型无差异;阳性细胞经冷冻复苏后仍能保持原有的特性.该细胞株的建立为进一步开展转拟蜘蛛拖丝蛋白基因的克隆羊研究奠定了基础. 相似文献
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利用pIRES2-EGF和pMX载体以及前期获得的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)构建逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP.采用磷酸钙法将pMX-2S-IRES-EGFP质粒转染到PlatE细胞并获得重组逆转录病毒.通过小鼠成纤维细胞系NIH3T3检测病毒侵染能力,并采用PCR法检测蜘蛛拖丝蛋白基因在NIH-3T3细胞的整合状况.结果显示,成功构建了逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP;通过感染NIH-3T3细胞测定重组逆转录病毒滴度约为2×105 cfu/mL;PCR鉴定结果显示,目的基因2S-IRES-EGFP已整合入NIH-3T3细胞基因组中. 相似文献
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为了筛选肌细胞特异表达MSTN基因RNA干涉序列的小鼠成纤维细胞株,研究利用人工合成的小鼠肌肉启动子SP,连接前期工作中获得带有GFP基因的小鼠MSTN基因RNA干涉载体pR-NAT-M1,构建真核表达载体pRNAT-SP-M1,将pRNAT-SP-M1线性化后转染小鼠成纤维细胞并通过300μg/mL G418筛选获得转基因阳性细胞。结果表明:获得的转基因阳性细胞呈现正常的小鼠成纤维细胞的梭形,且在荧光显微镜下呈现出表达绿色荧光蛋白的绿色;转基因阳性细胞的生长曲线呈"S"形;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍具有正常的细胞形态和增殖特性;PCR鉴定结果显示转基因阳性细胞基因组DNA中整合有pRNAT-SP-M1序列。说明成功获得了转肌细胞特异表达的MSTN基因RNA干涉序列小鼠成纤维细胞株。 相似文献
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蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK~R的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
《中国奶牛》2007,(Z1)
构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK~R,以200μg、500μg、1000μg、2 000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA317包装细胞,通过G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后收集病毒上清感染NIH_3T_3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×10~4CFU/mL。再用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织,产后奶样经FAPA法检测蚓激酶活性,结果表明牛奶具有明显的纤溶活性,即蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。 相似文献
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试验旨在获得具有毛囊表达特性的转蜘蛛牵丝蛋白基因细胞株。根据GenBank上发表的棒络新妇属蜘蛛的cDNA片段合成拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体S,加倍后连入pEGFP-N1框架载体以构建真核表达载体pK-2S,转染新疆美利奴细毛羊皮肤成纤维细胞后筛选单克隆,并通过PCR在DNA、RNA水平检测阳性克隆。基因合成后测序结果显示序列正确,酶切得到正确目的条带,筛选出阳性克隆并且可以在基因组及cDNA上扩增出目的片段。本研究成功将蜘蛛牵丝蛋白基因转入新疆美利奴细毛羊细胞,并在RNA水平表达,为培育毛囊特异表达蜘蛛牵丝蛋白基因并具有更高机械性能羊毛的新型细毛羊品种奠定基础。 相似文献
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鸡Bcl—2基因的克隆及其对卵泡闰细胞凋亡的影响 总被引:5,自引:1,他引:4
将鸡的Bcl-2基因克隆到真核表达载体JLV,构建了重组质粒JLVB。0.2μg/孔JLVB重组质粒经脂质体介导转染卵泡颗粒细胞,应用流式细胞术等方法分析了转染Bcl-2基因后原代细胞和传代细胞的生长与凋亡情况。与对照组相比,转染后的传代细胞分裂速度较快(P<0.01),凋亡比率较低,G2/M+S期细胞比例极显著高于对照组(P<0.01)。这些结果表明,Bcl-2基因具有促进细胞分裂、抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的作用,这种作用是直接的。在转染时间为12h、DNA量为0.3μg/孔的条件下,较好的脂质体介导用量的1.2μL/孔。 相似文献
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将鸡的 Bcl- 2基因克隆到真核表达载体 JL V中 ,构建了重组质粒 JL VB。 0 .2μg/孔 JL VB重组质粒经脂质体介导转染卵泡颗粒细胞 ,应用流式细胞术等方法分析了转染 Bcl- 2基因后原代细胞和传代细胞的生长与凋亡情况。与对照组相比 ,转染后的传代细胞分裂速度较快 (P<0 .0 1) ,凋亡比率较低 ,G2 / M S期细胞比例极显著高于对照组 (P<0 .0 1)。这些结果表明 ,Bcl- 2基因具有促进细胞分裂、抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的作用 ,这种作用是直接的。在转染时间为 12 h、DNA量为 0 .3μg/孔的条件下 ,较好的脂质体介导用量为 1.2 μL/孔。 相似文献
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采用脂质体法将具有抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的shRNA质粒pEGFP-N1-shRNA导入PK-15细胞中,经G418药物筛选后,分离扩增绿色荧光蛋白阳性细胞,获得抗PRRSV转基因PK细胞系。通过对转染方法和条件的优化,确立最佳的转染及筛选步骤;对得到的阳性转基因细胞进行冷冻-解冻,并作PCR检测。结果表明,G418最佳筛选浓度为600μg/mL,脂质体与质粒的最佳转染比例为7∶2,最佳转染时间为24 h。本研究成功建立抗PRRSV转基因细胞系,为进一步的功能验证及体细胞核移植奠定了基础。 相似文献
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蜘蛛能吐出具有优异机械特性的多种类型的丝,其中管状腺丝用于构建卵囊并具有良好的分子和机械性能,是目前唯一报道的全长cDNA序列的蜘蛛丝。基于为将来利用生物工程方法大量生产高性能的仿蜘蛛丝纤维提供基础信息,通过Bac-to-Bac/AcNPV杆状病毒表达系统,在强启动子驱动下,对2个大小不同的蜘蛛卵囊丝蛋白基因序列(全长cDNA序列和部分cDNA序列)与EGFP报告基因实现了在AcNPV昆虫细胞中的融合表达。绿色荧光和W estern印迹分析表明,被表达出的2个大小不同的卵囊丝融合蛋白在昆虫细胞胞质中呈现出明显不同的溶解性。含有部分卵囊丝基因的短EGFP-蜘蛛丝融合基因的表达产物在胞质里具有可溶性;而含有全长卵囊丝基因的巨大EGFP-蜘蛛丝融合基因的表达产物倾向于自我装配形成沉淀聚合物。研究结果也暗示了蜘蛛丝蛋白的分子大小可能对其装配成高性能的丝纤维有重要影响。 相似文献
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核糖体蛋白在蛋白质的生物合成、细胞的代谢与凋亡、机体免疫、信号转导等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)核糖体蛋白基因S3a的开放阅读框(ORF),ORF序列长795bp,编码264个氨基酸。序列比对表明,柞蚕S3a蛋白与其它10个物种S3a蛋白的相似性介于72%~99%之间,其中与柳蚕(Actias selene)S3a蛋白的相似性最高。用RT-PCR方法分析该基因在柞蚕幼虫组织中的表达情况,结果显示柞蚕S3a基因在柞蚕幼虫的血液、中肠、丝腺和脂肪体组织中均有表达,且转录水平无显著差异。SDS-PAGE和Westernblotting检测显示柞蚕S3a基因在大肠杆菌中获得了正确表达。 相似文献
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促细胞生长再生复合丝素蛋白电纺丝非织布的性能 总被引:2,自引:0,他引:2
利用家蚕丝素蛋白独特的力学和生物学特性,以电纺蚕丝纤维为载体,通过加入含有细胞粘附构型肽段(TGRGDSPAS)8的纯化细胞粘连性蛋白,改善丝素蛋白在促细胞生长方面的生物学功能。红外光谱检测表明,加入10%的细胞粘连性蛋白并不会明显影响丝素蛋白电纺丝的α-螺旋和β-构象,细胞培养试验中也表现出促进细胞增殖的作用,其活性细胞数目较单纯丝素蛋白纤维上的活性细胞增加,约为1.5×104cm-2,并对细胞形态没有影响。电镜扫描显示,以加入10%细胞粘连性蛋白后的电纺蚕丝纤维直径仍呈均匀分布状态。依据研究结果认为,以加入细胞粘连性蛋白的再生复合丝素蛋白电纺丝非织布纤维作为生物医学材料,具有更加良好的应用前景。 相似文献