香叶醇生物合成相关基因NUDX1的进化分析

茶树中存在2个亚细胞定位不同的NUDX1基因（CsNUDX1-cyto和CsNUDX1-chlo）,其中定位于细胞质的CsNUDX1-cyto基因与香叶醇生物合成密切相关。为探究NUDX1基因在不同茶树品种中的序列、功能差异及其在物种间的进化,通过序列比对、基因克隆、进化树构建、代谢物分析、功能验证等分析了该基因在茶树与非茶树植物中的进化以及香叶醇积累差异。结果表明,不同茶树基因库中组装的CsNUDX1s核苷酸序列存在差异;RT-PCR克隆显示4个阿萨姆变种和4个中国变种茶树中均有CsNUDX1-cyto和CsNUDX1-chlo的阳性克隆,且核苷酸序列存在差异。利用Phytozome网站数据进行序列比对及进化树构建,结果显示共有58个植物中存在CsNUDX1同源基因;该基因在植物物种间较为保守,在低等植物藻类基因组中也存在;在单子叶禾本科植物中,除短柄草（Brachypodium distachyon）泛基因组中存在蛋白序列匹配率大于58%的目的基因,其余均较低,尤其是在部分禾本科植物中该基因存在缺失。代谢物分析表明15个禾本科植物水稻、小麦和玉米品种鲜叶中均未检测到香叶醇的合成,而4个茶树品种嫩梢中香叶醇含量为0.87~4.12 μg·g^-1。此外,茶树CsNUDX1s基因在幼嫩叶片中有高表达;阿萨姆变种茶树佛香3号的CsNUDX1-cyto同样具有合成香叶醇的功能。本研究表明,NUDX1基因广泛存在植物基因组中,在茶树基因组中存在2个CsNUDX1s基因,并与茶树叶片中香叶醇的合成相关。     

茶树NUDIX基因家族的鉴定及表达分析

NUDIX水解酶属于焦磷酸酶，在信息传递、植物生长协调和响应逆境胁迫等方面起着重要作用。基于茶树(Camellia sinensis)基因组鉴定出43个NUDIX家族基因，并运用生物信息学和实时荧光定量PCR等方法对其分析。结果表明，43个CsNUDXs蛋白质分子量介于11.8～89.2 kDa，氨基酸长度为102～342个，理论等电点为4.49～9.26,18.6%的蛋白为稳定性蛋白；根据进化关系将CsNUDXs分为6个亚家族；启动子顺式作用元件分析发现CsNUDXs具有许多与激素响应、逆境胁迫和生长发育等调控相关的作用元件；对CsNUDXs家族基因在不同器官表达模式进行分析，发现CsNUDX3、CsNUDX7在果实中表达量较高，而CsNUDX22、CsNUDX25在果实中表达量极低，CsNUDX30在老叶中表达量极低；不同处理组的实时荧光定量PCR结果表明，1 mmol·L^-1茉莉酸甲酯(MeJA)处理下CsNUDX1、CsNUDX2和CsNUDX33等表达量呈现先升后降再升的趋势，而1 mmol·L^-1水杨酸(SA)处理下CsNUDX4...     

TCS1等位基因的差异表达参与弄岛野茶低咖啡碱的形成

本研究以弄岛野茶（MHLC）和云抗10号（YK10）茶树品种为实验材料,通过HPLC测定不同样品不同季节以及MHLC不同发育阶段叶和茎的生物碱含量;利用RT-PCR法克隆不同样品中的咖啡碱合成酶基因1(TCS1)的编码区,并对其表达量进行分析。结果显示：MHLC是一份天然低咖啡碱、高可可碱茶树种质资源,不同季节其可可碱含量均大于23.00 mg/g,而咖啡碱的含量不足4.00 mg/g;另外,MHLC芽中积累的咖啡碱和可可碱最高,在同一发育阶段下,叶片比茎具有更高的咖啡碱和可可碱,并且随着成熟度的提高,叶片和茎中的咖啡碱和可可碱均逐渐减少。通过基因克隆和定量分析发现：MHLC具有2种TCS1等位变异：TCS1b（仅具有可可碱合成酶活性）和TCS1d（同时具有可可碱和咖啡碱合成酶活性）,其中TCS1b的高表达、TCS1d的极低表达很可能是导致MHLC高可可碱、低咖啡碱的关键原因。本研究为低咖啡碱茶树育种提供材料,也为MHLC的有效利用提供分子基础。     

茶树CsMYB基因启动子的克隆与功能分析

以茶树新品系“1005”嫩芽为材料,克隆得到CsMYB基因gDNA全长序列1β828βbp,通过染色体步移技术,分离得到CsMYB基因启动子片段1β038βbp,命名为proMYB。生物信息学分析表明,CsMYB gDNA由2个内含子和3个外显子组成,该启动子含有与提高基因转录水平相关的5′UTR Py-rich stretch顺式作用元件、启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还存在有激素响应元件、光响应元件、逆境应答元件以及大量功能未知或功能特异的顺式作用元件,说明proMYB具有诱导型启动子特性,CsMYB基因在茶树植物体中可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号传导;通过烟草的瞬时表达结果表明,该启动子能驱动下游基因表达,具有启动子活性。     

不同茶树品种γ氨基丁酸含量及谷氨酸脱羧酶活性的研究

对13个茶树品种γ氨基丁酸（GABA）含量及谷氨酸脱羧酶（GAD）活性进行了分析,结果表明：不同茶树品种鲜叶GABA含量以及真空处理后的GABA含量和GAD活性均呈极显著差异。基于GAD活性,13个茶树品种可分为3类,其中第Ⅰ类包括3个大叶种,其GAD活性最高,均值为1．981μmol／30min：第Ⅱ类包括2个品种,...     

茶树N-甲基转移酶基因启动子克隆及功能分析

咖啡碱是茶叶中重要的功能物质,N-甲基转移酶（NMT）是其生物合成的关键酶。本研究以英红9号茶树新梢为材料,利用hiTAIL-PCR克隆NMT1基因启动子,并采用Plant CARE等在线软件分析其顺式作用元件。根据其元件组成,设计5'递减的启动子与GUS基因一起组建了融合载体转入烟草,利用GUS染色和定量PCR方法,分析了克隆的启动子功能及其对环境因子的响应。结果表明,克隆的NMT1基因启动子长767βbp,含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子基本元件及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。以5'递减的NMT1启动子替换pBI121中的CaMV35S启动子,构建出与GUS融合的pA、pB、pC、pD载体。在烟草叶片中进行瞬时表达,不同长度的NMT1启动子均具驱动GUS表达功能,且长度越长驱动能力越强。以含全长NMT1启动子载体pA对烟草转基因,转基因烟草各组织均检测到GUS基因的表达且表达量叶>茎>根,叶片中的表达量为根部的3倍。对转基因烟草进行不同程度光照、温度、模拟干旱和脱落酸处理后,除40℃温度条件外,其他处理的叶片中GUS基因表达在处理前后均存在显著变化,表明NMT1启动子功能受外界环境因子的胁迫影响。     

茶树肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆及表达分析

肉桂酸4-羟基化酶（Cinnamate 4-hydroxylase, C4H）是茶树苯丙烷代谢途径中的关键酶,能够影响木质素和类黄酮等次级代谢物的生物合成。本文采用5′-RACE技术,克隆了茶树肉桂酸4-羟基化酶基因（CsC4H）的全长序列,其中开放阅读框长1β518βbp,编码505个氨基酸,推测蛋白分子量为58.15βkD,理论等电点为9.29。利用基因组步移技术克隆得到该基因上游1β840βbp的启动子序列。该启动子区域除了分布有TAAT-box和CAAT-box等基本转录元件外,还存在多个诱导型和组织特异型的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果表明该基因在芽、叶、茎、根中都有表达。将该基因重组至表达载体pYES-DEST52上,并在酿酒酵母WAT11中进行真核表达。利用LC-MS方法检测酶反应产物,结果表明目的蛋白能够催化肉桂酸生成p-香豆酸。     

铁皮石斛DoAGL6基因及启动子克隆与分析

AGL6基因是MADS-box转录因子家族中的一员,是植物特有的转录调控因子,参与花器官形成,对唇瓣的形成起到关键作用。获得铁皮石斛DoAGL6基因及其启动子,并进行生物信息学分析,对DoAGL6基因启动子进行瞬时表达活性验证,可为进一步研究DoAGL6基因的功能提供参考。本研究克隆DoAGL6基因及其上游的启动子序列,利用在线软件对克隆得到的目的基因序列、启动子序列进行预测,分别构建由全长启动子和5'端缺失启动子驱动GUS的重组表达载体并瞬时转化拟南芥及铁皮石斛原球茎,探究其表达活性。结果表明,成功克隆了DoAGL6基因及其启动子,DoAGL6基因编码区长729 bp,编码243个氨基酸,编码蛋白分子式为C₁₂₁₃H₁₉₅₅N₃₅₉O₃₇₅S₁₂,预测亚细胞定位于细胞核中;保守结构域分析表明,DoAGL6具有保守的MADS-box和K-box两个结构域,属于MADS基因家族MIKC亚家族。启动子序列长度为1891 bp,顺式作用元件分析结果显示,DoAGL6基因启动子中除了核心启动元件TATA-box、CAAT-box外,还有许多其他顺式作用元件,如脱落酸响应元件（ABRE）、光反应顺式调节元件（G-Box）、茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif）、MADS-box蛋白结合位点（GArG-Box）等。成功构建融合表达载体pCAMBIA1300-A1-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A2-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A3-promoter::GUS,拟南芥和铁皮石斛原球茎瞬时转化及GUS组织化学染色结果表明,随着启动子5'端缺失片段的增长,GUS活性逐渐降低,启动子活性逐渐减弱,即全长启动子A1（-1891~1）的活性最强,5'端缺失片段A2（-1488~1）次之,A3（-784~1）活性最弱。瞬时转化后的拟南芥和铁皮石斛原球茎GUS染色均呈现蓝色,但与对照相比均较浅,说明全长启动子和2个5'端缺失启动子都具有驱动GUS的活性,但启动活性都比CaMV35S启动子的启动活性弱。     

巴西橡胶树HbWRKY1基因5′调控序列的克隆及功能初步鉴定

为深入研究巴西橡胶树HbWRKY1基因的表达调控机制,采用染色体步移法克隆了HbWRKY1基因的5′调控区序列。结果表明,该序列具有预测的核心启动子区域位于-6~-57 bp,转录起始位点位于翻译起始位点上游41 bp处;该序列具有TATA-box,CAAT-box和GATA-box等多个典型的真核生物启动子基本的顺式作用元件,同时还具有低温响应元件LTR,赤霉素反应元件GARE-motif,生长素响应元件TGA-element和脱落酸响应元件ABRE等参与激素调控元件,此外还有与MYB结合的MBS元件,热胁迫反应的HSE,厌氧诱导元件ARE和增强诱发厌氧反应的GC-motif等顺式作用元件。构建了不同长度的HbWRKY1启动子片段的植物表达载体并转化本生烟草, 通过潮霉素抗性和PCR鉴定,获得了转基因植株。对获得的转HbWRKY1不同长度启动子片段的转基因T1植株GUS染色发现,植株的茎、叶柄、主叶脉和根中均可呈现蓝色,表明HbWRKY1基因的5′调控区可以启动GUS基因的表达, 具有启动子的活性。     

巴西橡胶树HbWRKY1基因5'调控序列的克隆及功能初步鉴定

为深入研究巴西橡胶树HbWRKY1基因的表达调控机制,采用染色体步移法克隆了HbWRKY1基因的5'调控区序列.结果表明,该序列具有预测的核心启动子区域位于-6～-57 bp,转录起始位点位于翻译起始位点上游41 bp处;该序列具有TATA-box,CAAT-box和GATA-box等多个典型的真核生物启动子基本的顺式作用元件,同时还具有低温响应元件LTR,赤霉素反应元件GARE-motif’生长素响应元件TGA-element和脱落酸响应元件ABRE等参与激素调控元件,此外还有与MYB结合的MBS元件,热胁迫反应的HSE,厌氧诱导元件ARE和增强诱发厌氧反应的GC-motif等顺式作用元件.构建了不同长度的HbWRKY1启动子片段的植物表达载体并转化本生烟草,通过潮霉素抗性和PCR鉴定,获得了转基因植株.对获得的转HbWRKY1不同长度启动子片段的转基因T1植株GUS染色发现,植株的茎、叶柄、主叶脉和根中均可呈现蓝色,表明HbWRKY1基因的5'调控区可以启动GUS基因的表达,具有启动子的活性.     

茶树硒营养代谢关键酶ATP硫化酶基因克隆及启动子结构分析

为探明茶树硒营养代谢关键酶基因ATP硫化酶的表达调控规律,通过PCR获得APS的DNA全长序列,应用genome walking克隆了APS基因的5’侧翼序列,采用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,为深入研究茶树硒营养代谢关键酶的表达调控机制奠定了理论基础.     

茶树新梢内源激素与叶片色泽形成的调控关系研究

以3个紫化茶树品种（系）（紫福星1号、紫娟、红叶1号）、2个绿叶品种（肉桂、福鼎大白茶）以及1个白化品系（白鸡冠）为供试材料,对主要呈色物质（花青素、叶绿素、类胡萝卜素）以及三类植物激素[脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）]的含量进行检测。结果表明,紫化茶树品种的花青素和ABA含量普遍较高,两者呈极显著正相关;ABA与叶绿素、类胡萝卜素则呈显著负相关。通过分析紫化茶树不同叶位的ABA与花青素含量,结合两者相关基因在不同叶色茶树叶片中的表达情况显示,ABA对茶树花青素合成起促进作用。     

茶树OSCA基因家族的鉴定及表达分析

钙通透性阳离子通道蛋白（OSCA）在植物调节高渗胁迫中发挥着重要作用。为了解OSCA基因家族在茶树响应干旱胁迫中的作用,本研究基于茶树全基因组数据对OSCA基因家族进行鉴定,分析CsOSCAs基因和蛋白结构以及启动子顺式作用元件,并对CsOSCAs在茶树不同组织、不同抗旱性品种间和干旱胁迫下的表达模式进行分析。结果表明：茶树基因组包含12个OSCA基因家族成员,分别命名为CsOSCA1～CsOSCA12;CsOSCAs基因编码的氨基酸序列长度为667～831 bp,蛋白分子量在76 630.55～93 563.99 kDa之间,等电点在6.15～9.33之间,含有9～12个跨膜结构域,均含有特征保守结构域DUF221,根据系统进化关系可以分为4个亚族;10个CsOSCAs基因定位于茶树7条染色体上,2个CsOSCAs基因定位于未锚定染色体的contig上;CsOSCAs基因编码的蛋白二级结构含有32%～38%的跨膜结构和60%～68%的α-螺旋;CsOSCAs基因具有组织表达特异性,CsOSCA2、CsOSCA3、CsOSCA11、CsOSCA12基因在干旱敏感的品种CN98中的表达量...     

基于高通量测序筛选‘紫娟’花青素合成相关的miRNA

为筛选调控紫娟茶树花青素合成相关miRNA,以茶树品种紫娟（ZJ）、云抗10号（YK）和福鼎大白茶（FD）为材料,构建了miRNA文库。鉴定出46种已知的miRNAs和67种新的miRNAs,预测到具有注释的靶基因765个。通过差异表达分析,筛选出在ZJ与YK、ZJ与FD共有差异表达的miRNA 24个。通过对24个差异表达miRNA的靶基因分析,筛选出可能参与调控花青素合成的miRNA 4个,包括miR828a、miR845c、novel_14和novel_87,其预测的靶基因包括转录因子基因MYB4、MYB23、MYB26、MYB82、bHLH74以及4-香豆酰辅酶A链接酶（4CL）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和UDP-葡萄糖黄酮3-O-葡糖基转移酶（UFGT）等基因。利用RT-PCR分析8个差异表达的miRNA,其结果与转录组分析一致。本研究结果为进一步开展茶树花青素生物合成的调控机制研究奠定基础。     

小贯小绿叶蝉取食诱导抗、感茶树品种挥发物的释放

为研究不同抗性水平茶树应对小贯小绿叶蝉取食诱导的挥发物释放及相关代谢机制,以抗虫茶树品种举岩（JY）和感虫茶树品种恩标（EB）为试验材料,利用动态顶空收集法结合GC-MS技术检测茶树在小贯小绿叶蝉取食不同时间（6、12、24、36、48、72βh）释放的主要挥发物组分,并结合转录组数据分析主要挥发物合成途径上的相关基因的表达水平及其调控趋势。结果表明,在健康状态下,茶树释放的挥发性物质较少;在虫害后不同时间段的茶样中检测到顺-β-罗勒烯（β-Ocimene）、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯[(E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene,DMNT]、芳樟醇（Linalool）、法尼烯（Farnesene）等10种主要挥发物。其中,单萜类物质在虫害诱导的感虫品种茶树上含量高,倍半萜类物质在虫害诱导的抗虫品种茶树中含量高。转录组数据显示,小贯小绿叶蝉取食诱导抗、感茶树品种中调控萜类合成的关键基因均被明显激活。调控单萜类物质合成的相关基因在感虫茶树品种中的表达量相对较高,而调控倍半萜类物质合成的相关基因在抗虫品种中的表达量与感虫品种差异不显著。本研究结果为茶树抗虫机制和小贯小绿叶蝉绿色防控提供一定的理论依据。     

茶树品种对茶饼病的抗性研究

通过对云南省选育和推广的4个茶树品种进行室内离体接种抗病性鉴定和田间品种抗病性调查。结果表明，4个品种均不同程度地感染茶饼病，其发病率和病情指数存在着一定差异（云抗10号〈佛香3号〈佛香2号〈佛香1号），但按照抗性分级标准分别属于高抗和中抗品种；室内离体接种不同浓度孢子发病情况试验表明，最适的接种孢子浓度为显微镜10×10倍数下每视野50-60个孢子。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

木薯低温诱导基因MeLTI6A的启动子的克隆与序列分析

MeLTI6A（Manihot esculenta low temperature inducible 6A）是木薯低温干旱诱导基因,本研究从MeLTI6A 的序列出发,利用电子克隆设计引物进行PCR扩增的方法获得该基因的启动子,其序列共1 304 bp。生物信息学分析发现该启动子中具有真核生物典型的核心启动子区（TATA-box和CAAT-box）,并利用α-互补,蓝白斑筛选原理验证了该启动子核心序列具有活性;该启动子具有与干旱胁迫相关的激素类（如脱落酸、乙烯）的响应元件和逆境胁迫（如低温、干旱胁迫）的响应元件;还具有与木薯组织特异表达相关的调控元件和其它光响应元件;并通过Real time PCR检测了低温胁迫（4 ℃）下的木薯组培苗中MeLTI6A的表达变化,说明了该启动子区的低温胁迫顺式作用响应元件可能调节MeLIT6A在低温胁迫下的表达。这些说明木薯的MeLIT6A基因可能是通过对干旱胁迫激素信号响应以及逆境胁迫响应起作用,使木薯获得一定的抗胁迫的能力,同时还可能参与了木薯相关组织发育过程的调控。本研究有利于对MeLTI6A基因抗逆境胁迫功能的理解,为探索木薯高效抗逆的分子机制作初步研究。     

茶树花粉中丙酮酸脱氢酶(CsE1α)的定位分析及其启动子的克隆与表达

根据以往试验获得的Cs E1α的c DNA全长序列,利用TAIL-PCR克隆Cs E1α启动子。测序验证与生物信息学分析后发现,该启动子片段长336 bp,含有2个CAAT-box,2个TATA-box,2个GATA-box,1个LTR,1个G-box等顺式作用元件。构建载体转入洋葱内表皮细胞瞬时表达,启动子可启动下游报告基因,使荧光蛋白表达于整个细胞,表明所克隆的启动子具有启动功能。Cs E1α与GFP融合蛋白瞬时表达表明Cs E1α定位于线粒体。本实验为下一步转基因拟南芥稳定表达,进一步研究Cs E1α基因的表达调控,探讨茶树花粉抗寒的分子生物学机理奠定基础。     

不同茶树品种鲜叶多糖的理化性质和抗氧化活性比较研究

选取来自同一茶园且具有代表性的黄金桂、铁观音、祁门种、六堡茶、大红袍、槠叶齐、龙井43、白叶1号、中黄1号和福鼎大白茶10个茶树品种鲜叶为原料,直接进行微波干燥固样,通过水提法制备10个不同茶树品种的多糖,采用化学分析、高效液相色谱、红外光谱、凝胶色谱层析、扫描电镜、测量粒径和Zeta电位等方法比较分析10个茶多糖的主要理化性质,并测定其1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除能力和铁离子还原能力等体外抗氧化活性。理化性质结果表明,茶多糖是一类水溶性的酸性糖蛋白,主要由糖醛酸、中性糖、蛋白质和多酚构成;10个茶多糖的单糖组分主要由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成;主成分分析（PCA）表明,白叶1号和龙井43与其他茶树品种在多糖的基本组成上具有较大差异。体外抗氧化研究表明,不同茶树品种多糖的体外抗氧化能力存在显著差异,但均随其浓度增加而呈线性增加,其中白叶1号多糖的抗氧化活性整体表现最为优异。理化性质与抗氧化活性的相关性分析结果显示,不同茶树品种多糖的抗氧化能力可能与其所含的多酚和蛋白质含量有关。