鹅星状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×10~1拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。     

GPV·MDPV和FAdV-4三重PCR检测方法的建立

[目的]为快速地鉴别鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和禽腺病毒血清4型(FAdV-4)3种病毒,建立一种特异强、敏感高、重复性好的三重PCR检测方法.[方法]根据Genbank登录的MDPV、GPV和FAdV-4的基因序列,设计3对特异性引物,以提取的核酸为模板,进行PCR特异性、敏感性和重复性试验.[结果]采用所建立的方法能够扩增出GPV、MDPV和FAdV-4特异性片段,且不能检出鸭黄病毒(DFV)、鸭I型肝炎病毒(DVH-Ⅰ)和禽呼肠孤病毒(ARV);GPV、MDPV和FAdV-4核酸模板的最低检测量分别为20、2、2 pg;对8份阳性临床病料进行检测,可见MDPV、GPV和FAdV-4的检出率均为100％.[结论]建立的三重PCR检测方法能够对MDPV、GPV和FAdV-4这3种病毒进行快速、准确的诊断.     

鸡传染性喉气管炎病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立

旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好...     

TaqMan–MGB探针荧光定量PCR检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌

根据pir AVp基因保守序列设计特异性引物和TaqMan–MGB探针,经优化反应体系及条件,建立检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的TaqMan–MGB探针荧光定量PCR方法;以重组质粒为标准品制作标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。结果表明:该方法定量范围宽,起始模板浓度范围为1×101～1×109拷贝/反应时,标准曲线具良好的线性关系;最低检测限约为10拷贝/反应,与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应,重复试验变异系数为0.37%～0.47%,可在1 h内完成单个样品检测;对临床对虾样品及水样的检测结果表明,与世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式PCR法相比,可提高VpAHPND的阳性检出率,且检测为阳性的样品包含全部套式PCR法检测为阳性的样品。可见,应用TaqMan–MGB探针建立的检测VpAHPND的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点,可用于临床对虾样品及水样的VpAHPND检测。     

舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、灵敏的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)检测方法。【方法】以舒伯特气单胞菌rpoD(RNA polymerase sigma-70 factor)为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立舒伯特气单胞菌的TagMan实时荧光定量PCR检测方法,同时验证该方法的特异性、灵敏度、重复性,并用该方法对50份临床样品进行检测,验证其应用效果。【结果】含舒伯特气单胞菌rpoD基因的质粒拷贝数与循环阈值(Ct)的标准曲线相关系数为1.000,扩增效率为94.705%。实时荧光定量PCR检测方法只对舒伯特气单胞菌的靶基因检测结果呈阳性,对嗜水气单胞菌(Aeromanas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、诺卡氏菌(Nocardia seriolae)等其他14种致病菌的检测结果均为阴性,具有高度特异性;对舒伯特气单胞菌重组质粒和纯培养细菌的检出灵敏度分别为4.76拷贝/μL和15 CFU/mL;批内和批间重复性试验变异系数分别为0.95%和1.05%。50份临床样品检测结果显示,该方法阳性样品检出率为22%,高于传统细菌分离方法(10%)的检出率。【结论】建立的舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于舒伯特气单胞菌的快速诊断检测和流行病学调查。     

牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立特异性强、灵敏度高、重复性好的产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，本试验根据产气荚膜梭菌的plc基因保守序列设计合成特异性引物探针，摸索其最佳反应条件，进行灵敏性、特异性、重复性以及临床样本验证。结果表明：建立的方法具有较好的灵敏性、特异性及重复性，最低检出限度为8.26×10¹拷贝/μL，在8.26×10³～8.26×10⁸拷贝/μL的范围内具有良好的线性关系，同时不与其他致病菌发生交叉反应，组间及组内的变异系数均小于4%，应用比方法在采集的300份临床样品中检出24份阳性样品，与常规细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。说明试验成功建立了牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，这将为牛产气荚膜梭菌的快速诊断提供技术支持。     

鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)NS1基因序列设计合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测GPV核酸的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数达到0.998;对初始模板的检出下限为30个拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与鸭瘟病毒、犬细小病毒、新城疫病毒和鹅副粘病毒均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于2%。用建立的Real-time PCR检测13例GPV感染阳性病例,GPV阳性检出率为100%。表明建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于GPV的病原检测及定量分析。     

GCLV病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的大蒜普通潜隐病毒(GCLV)的外壳蛋白基因的保守序列设计了一对引物,以全基因序列合成的方法获得质粒标准品,以此质粒标准品为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测GCLV的方法.该方法在4.2×101~4.2×107拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为106%,最低可检测42拷贝/PCR反应阳性标准品,比常规PCR敏感100倍;扩增产物的溶解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,溶解温度为(77.5±0.9)℃;重复性好,组内变异系数为0.2%~1.1%.用该方法对疑似带病的大蒜材料进行检测,结果表明GCLV-SYBR GreenⅠPCR特异性强,操作简便,敏感性高,可以用于GCLV感染的检测及定量分析.     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒（ENTV-2）SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种快速、敏感的ENTV-2检测方法,用于ENT的早期诊断与流行病学调查。【方法】通过生物信息学的方法将ENTV-2与ENTV-1、ERVs、JSRV进行比对,寻找ENTV-2的保守序列并设计1对特异性引物,建立SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的PCR反应条件进行优化,将PCR扩增产物连接T载体构建的阳性质粒作为标准品,对SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】建立的检测ENTV-2 qPCR方法标准曲线呈现良好的线性关系(R~2=0.992);该方法的特异性良好,对ENTV-2可以产生特异性扩增曲线,与ENTV-2高度同源的ERVs没有交叉反应,也无法扩增羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)等常见病原;敏感性良好,最低检测限度为7.5×10~2 copies·μL~(-1),敏感性可达常规PCR检测方法的100倍;批内、批间的变异系数CV1%,重复性良好;对81份临床样品的阳性检出率为17.3%。【结论】建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法特异性良好,敏感性较高,重复性良好,为山羊地方性鼻内肿瘤的早期、快速检测提供了技术支持。     

锦鲤疱疹病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用

为建立快速有效的锦鲤疱疹病毒病检疫方法,根据锦鲤疱疹病毒(KHV)聚合酶基因(Sph)的保守序列设计1对引物和相应的TaqMan探针,建立了一种快速检测锦鲤疱疹病毒病荧光PCR方法。用建立的检测方法对细胞培养物进行检测,并与常规PCR对比,结果荧光PCR灵敏度高于普通PCR,能检出的最低拷贝数为1.6×102/μL。应用该方法对样品进行检测,结果表明:所建立的荧光PCR检测方法4 h内可报告检测结果。该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等特点,适用于锦鲤疱疹病毒的快速检疫。     

基于ENO基因的猪附红细胞体病 PCR-ELISA检测方法的建立

为建立猪附红细胞体病的PCR-ELISA检测方法,试验根据猪附红细胞体ENO基因序列,设计合成1对分别标记生物素(BIOT)和地高辛(DIG)的引物,进行PCR-ELISA检测。通过对包被液的种类和浓度、结合抗体的反应条件、封闭条件、PCR产物的稀释度及显色时间等条件进行优化,确定阴性、阳性判定的阈值,并进行特异性、敏感性及重复性验证。结果表明:该方法与猪链球菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、弓形虫等均无交叉反应;敏感性比常规PCR高10倍,最低检出量为1.77×10~6拷贝/μL;对40份猪血液样品的,阳性检出率为22.5%。该试验建立的方法具有特异、敏感、安全等优点,将为猪附红细胞体病的临床诊断提供更准确、实用的检测方法。     

鸡马立克氏病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测鸡马立克氏病病毒(MDV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法。【方法】针对马立克氏病毒特异的Meq基因序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ染料建立检测马立克氏病毒的实时荧光定量PCR方法,进行敏感性、特异性、重复性试验,并应用该方法检测了罗曼蛋鸡、AA肉鸡、二郎山山地鸡SD02和SD03品系4种鸡只感染组和对照组样本的脾、法氏囊、胸腺等组织中的病毒拷贝数。【结果】该方法建立的定量标准曲线荧光阈值循环数(Threshold cycle,Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.996),扩增效率(E)为96%,熔解曲线分析显示其PCR扩增具有良好的特异性,敏感性和重复性试验证明该方法具有较高的灵敏度和稳定性,最低检测浓度为102拷贝/μL。同时运用该方法对试验样本进行检测,结果显示在4个感染组鸡只的肝,脾,肾,胸腺,法氏囊组织中均检测出Meq的拷贝,并计算出了待测样品的病毒拷贝数,相反在未感染组却没有检测出任何Meq的拷贝。试验结果还发现二郎山山地鸡两品系各组织中MDV的拷贝数显著低于AA肉鸡和罗曼蛋鸡各组织。【结论】建立的检测方法能够快速检测马立克氏病毒,结果准确,成本低廉,可以将其作为生产上监控马立克氏病的一个重要手段。     

猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立猪乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,根据E基因序列,设计1对特异性引物,建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度达到10~3拷贝/μL,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠,荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。     

猪非典型性瘟病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、准确检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,根据GenBank发布的APPV NS2基因序列,设计合成1对扩增后目的基因片段大小为500 bp的特异性引物。建立的RT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性,该方法对APPV的最低检出量为1μl 4.95×10~4拷贝,重复性试验中组间、组内试验结果均与预期相符。应用该方法对68份疑似患病的仔猪样品进行检测,阳性病料检出率为7.35%。利用Mega7.0绘制APPV系统进化树,对APPV进行遗传进化分析,结果显示本试验检出的APPV(SC株)与中国报道的APPV的亲缘关系较近。建立的APPV RT-PCR检测方法可用于APPV的临床诊断及流行病学检测。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量PCR检测方法的建立及在初乳检测上的应用

为了提高初乳中猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的检出率,避免初生仔猪受到带毒初乳的危害,建立了一种SYBR GreenⅡ荧光定量PCR(qPCR)检测方法。根据Gen Bank已发表的TGEV的N基因序列,选择保守区域设计、合成了1对特异性引物,扩增TGEV的N基因片段(174 bp),构建含有N基因片段的重组质粒,以重组质粒作为模板建立了特异性检测TGEV的qPCR检测方法。该方法的灵敏性比普通PCR方法高,应用建立的qPCR检测方法,对2016年10月-2017年4月采集自四川省部分地区腹泻猪场的母猪初乳130份进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较。结果显示:用qPCR方法检测,130份样本中有13份为TGEV阳性,而普通PCR方法只检测到5份TGEV阳性样本。说明qPCR检测方法的敏感性高于普通PCR方法,更适合用于猪初乳检测。     

牛冠状病毒TaqMan荧光定量检测方法的建立及国内部分地区流行病学调查

牛冠状病毒(BCoV)在全球广泛存在，在临床上能引起牛腹泻以及呼吸道感染，给养殖业带来巨大经济损失。为快速批量检测临床样品、分析国内的BCoV隐性感染及流行情况，根据BCoV的N基因序列设计了引物和探针，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，对其特异性、敏感性、重复性进行评估，并将其与靶向BCoV的N基因的常规RT-PCR方法进行对比。利用本方法对采集自我国西藏、江苏、河北、贵州、安徽等5个省份的22个未发病牛场的35份口腔拭子样品和244份粪便样品进行检测以了解流行情况。结果表明，质粒标准品拷贝数的对数与C_T值呈现良好稳定的负线性关系，标准曲线为y=-3.441 8x+39.584 0,r²=0.999 4,E=98.2%;最低检测拷贝数为6.0×10拷贝/μL,重复性变异系数均<5%;对临床样品进行检测，检出率明显高于常规RT-PCR方法。对22个牛场的279份病料进行检测，结果显示BCoV的总体阳性率为73.12%,牛场阳性率为100.00%。本研究成功建立了靶向BCoV N基因、灵敏度高、特异性好的荧光定量RT-PCR...     

3种猫疱疹病毒Ⅰ型检测方法的比较

比较传统PCR、荧光定量PCR以及胶体金速测卡对于猫疱疹病毒Ⅰ型（FHV-1）检测的敏感性及准确性。设计引物,优化反应条件并扩增目的片段,定向插入pMD-19T克隆载体,最后用建立的2种PCR检测方法及猫疱疹病毒1型快速检测卡对21份临床疑似猫疱疹病毒感染的分泌物进行检测。荧光定量PCR和传统PCR检测的最低拷贝数分别为20拷贝和207拷贝;荧光定量PCR、传统PCR以及胶体金快速检测卡的检出率分别为71%、57%和29%。传统PCR及荧光定量PCR检测方法均具有良好的特异性,其中荧光定量PCR特异性显著,相比猫疱疹病毒1型快速检测卡敏感性好,准确率更高。     

单核细胞增生李斯特菌qPCR检测方法的建立及应用

【目的】为了建立一种快速、准确、可靠的畜产品中单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测方法。【方法】根据保守序列设计并筛选出一对特异性引物，经过反应体系及程序优化，建立染料法qPCR检测方法，并使用临床样品评价该检测方法的效果。【结果】建立的qPCR方法特异性较好，扩增，对纯培养细菌的检测限可达到10² CFU/mL,检测方法变异系数小，稳定性高；对生猪肉和牛奶人工污染模型中的检测限为10³ CFU/mL,比普通PCR灵敏度高10倍。使用qPCR分别对50份牛奶样品和生猪肉样品检测，阳性率均为2.00%,与普通PCR方法验证结果一致。【结论】成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR方法，可以用于临床样品单核细胞增生李斯特菌的检测。     

用荧光定量RT-PCR方法检测新型鸭呼肠孤病毒

根据新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)S1基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅠ的实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据含目的基因的质粒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。敏感性试验显示,该方法最低可检出15个拷贝的病毒c DNA,其病毒最低检出量为0.5TCID50。该方法具有良好的特异性,对鸭坦布苏病毒(DTMUV)、A型鸭甲肝病毒(DHV-1)、C型鸭甲肝病毒(DHV-3)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭新城疫病毒(NDV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭疫里默氏杆菌(RA)的检测结果均为阴性。该方法重复性好,组内变异系数为0.32%~0.91%,组间变异系数为1.03%~1.51%。利用该方法对人工感染雏鸭的粪便排毒情况进行检测,结果发现,攻毒后2~12 d是粪便排毒期,其中3~6 d是排毒高峰期。临床样品检测结果表明,该方法比常规RT-PCR具有更高的敏感性,而且从收到样品到得出检测结果只需4 h。     

猪瘟病毒实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测猪瘟病毒的基因检测方法,根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)基因组NS2基因序列设计并合成引物和Taq Man探针,通过各项条件优化并以10倍稀释度的质粒为标准品进行实时定量PCR扩增制作标准曲线,建立检测CSFV的实时定量PCR方法。该方法的检测灵敏度可达每微升10个拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高出1个数量级;对标准品质粒检测的线性范围是1.0×109～1.0×101μL-1。对1.0×107、1.0×105、1.0×103μL-13种稀释度的标准品质粒进行重复试验,批内变异系数分别是0.30%、0.85%、0.43%,批间变异系数分别是0.81%、1.36%、0.63%,具有良好的重复性。应用该方法对45份临床样品进行检测,检出26份阳性样品,而常规PCR只检测出19份阳性样品,说明该实时定量PCR方法的敏感性高于常规PCR。可见,该方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可用于检测病料中的猪瘟病毒。