南美白对虾4种病原体可视化快速检测试剂盒(生物芯片法)的研发

利用反向点杂交技术,研制灵敏度较高的南美白对虾4种病原体检测试剂盒,其检测指标包括致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾肝肠胞虫(EHP),用重组质粒分别对其进行了最低检测限测试,并与现有推荐方法进行比较。本研究研发的检测试剂盒对4种病原体的最低检测限为1μl 10～100拷贝。特异性检测结果表明,4种病原体彼此不产生交叉反应,特异性良好,与各病原体推荐检测方法的结果相比,阳性符合率完全一致。本研究研发的检测试剂盒具有操作方便,灵敏度高,特异性好,检测时间短,设备要求简单等特点,适合应用于南美白对虾VpAHPND、WSSV、IHHNV、EHP的检测、筛查工作中。     

虾肝肠胞虫环介导等温扩增法(LAMP)的建立

为建立一种快速检测虾肝肠胞虫(EHP)的环介导等温扩增法(LAMP),根据Gen Bank中登录的EHP-SSU基因序列设计6条特异性引物,成功建立了EHP-LAMP检测方法。该方法检出限为3.71个质粒拷贝/μL,并且与虾其他常见病毒病的病原(WSSV、IHHNV、CMNV)均无交叉反应。采用LAMP方法和常规PCR方法对30份具有典型EHP感染症状的对虾样品进行检测,结果显示:LAMP和PCR方法的阳性检出率均为100%。结果表明,建立的EHP-LAMP方法具有高灵敏度、高特异性、高准确度的优点,为对虾肝肠胞虫的快速早期诊断奠定基础。     

基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法

【目的】基于TaqMan-MGB探针建立虾肝肠胞虫(EHP)荧光定量PCR检测方法,为EHP的快速定量检测及实时监测提供技术手段。【方法】以EHP的SSU rDNA基因为检测靶基因,在其保守区设计特异性的扩增引物和TaqMan-MGB探针,将PCR扩增目标片段克隆至pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-T-SSU~(EHP)(标准品),以标准品DNA为模板优化反应体系,建立检测EHP的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR;以10倍梯度稀释的标准品DNA为模板构建扩增标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的重组质粒pMD18-T-SSU~(EHP )DNA稳定性好,可满足作为标准品和阳性对照的要求;标准品(pMD18-T-SSU~(EHP))起始模板范围为2.0×10~1～2.0×10~9拷贝/反应时,建立的标准曲线线性关系良好,对应的线性回归方程为y=-3.232×lg(x)+39.51。基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR对标准品的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对临床虾样品EHP的检测灵敏度约10拷贝/mg,较农业农村部推荐的套式PCR约提高10倍;对虾类其他常见病原均无扩增反应,其组内和组间变异系数分别为0.26%～0.72%和0.56%～0.92%,整个检测过程可在1 h内完成。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与套式PCR同时对276份临床虾样品进行检测比较,发现两种方法的符合率为96.7%,检测低拷贝数虾样品时前者具有更高的灵敏度;2018和2019年广西虾样品的EHP阳性检出率分别为16.2%和30.6%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品的EHP定量检测,可为EHP实时监测及EHPD快速诊断提供一种新的技术手段。     

TaqMan–MGB探针荧光定量PCR检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌

根据pir AVp基因保守序列设计特异性引物和TaqMan–MGB探针,经优化反应体系及条件,建立检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的TaqMan–MGB探针荧光定量PCR方法;以重组质粒为标准品制作标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。结果表明:该方法定量范围宽,起始模板浓度范围为1×101～1×109拷贝/反应时,标准曲线具良好的线性关系;最低检测限约为10拷贝/反应,与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应,重复试验变异系数为0.37%～0.47%,可在1 h内完成单个样品检测;对临床对虾样品及水样的检测结果表明,与世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式PCR法相比,可提高VpAHPND的阳性检出率,且检测为阳性的样品包含全部套式PCR法检测为阳性的样品。可见,应用TaqMan–MGB探针建立的检测VpAHPND的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点,可用于临床对虾样品及水样的VpAHPND检测。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型的核酸恒温扩增微流控快速检测芯片的建立

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)主要感染锦鲤、鲫鱼及其变种,导致造血器官坏死,其致死率高,给养殖业造成了巨大损失。为建立一种快速、灵敏、准确的CyHV-2检测方法,可于大规模暴发之前进行疫情的早期诊断和及时防控,对CyHV-2建立了一种集核酸快速提取方法、竞争性互补介导核酸恒温扩增(competitive annealing mediated isothermal amplification,CAMP)与微流控芯片(microfluidic chip)于一体的检测方法。以CyHV-2基因保守区域片段为靶序列设计特异性引物,通过条件优化建立了一种基于CAMP技术的CyHV-2可视化检测方法,并且对该方法进行了特异性、灵敏性及临床样本的检测进行评估。结果表明:所建立CAMP方法的灵敏度最低检测限为10拷贝;对与其基因型有较高相似性的鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus3,CyHV-3)无非特异性扩增,特异性良好;用本方法对89批次的临床样本进行检测,显示灵敏度及特异性均为100%。核酸快速提取的方法能够较快获得纯度较高的核酸,缩短了核酸提取时间,且极大节约了检测成本,具有操作简单、样本用量少等特点,且经核酸快速提取方法处理的病鱼组织样本能够满足CAMP现场检测的要求。此外,将针对CyHV-2所建立的CAMP可视化检测方法结合微流控芯片,可实现多目标病原的高通量、多指标筛查,将极大提高检测效率。本试验对鲤疱疹病毒Ⅱ型所建立的核酸快速提取、CAMP检测及微流控芯片的方法可在70min内实现对该病毒的现场快速检测及诊断,极大地提高了对CyHV-2疫病的早期防控能力,将为CyHV-2的快速检测及疫情早期预警提供参考。所建立的方法亦可应用于其他经济水生生物病原的现场快速检测及后续防控。     

微流控芯片恒温扩增技术快速检测米饭中的蜡样芽孢杆菌

为建立米饭中的蜡样芽孢杆菌微流控芯片恒温扩增快速检测方法,利用蜡样芽孢杆菌公开的hblA基因序列设计引物,加入荧光染料SYTO-9,采用微流控芯片通过环介导恒温扩增进行实时荧光读数,并通过24株菌株验证其特异性;分别用阳性质粒和阳性菌株测试其灵敏度、检出限和重复性。结果表明:2株蜡样芽孢杆菌呈阳性,22株非蜡样芽孢杆菌呈阴性;微流控芯片恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌菌液的灵敏度为170 CFU/mL,检测时间在35 min内;使用合成的蜡样芽孢杆菌阳性质粒样品,其灵敏度为10μL-1,检测时间在15 min内,比传统分离鉴定方法的灵敏度高10倍;人工污染米饭中蜡样芽孢杆菌的检出限为570 CFU/g,并可在45 min内完成结果判定;蜡样芽孢杆菌阳性质粒检测重复性好,其变异系数(coefficient of variation, CV)为2.02%。综上所述,微流控芯片恒温扩增快速检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确,可用于米饭类食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测。     

实时定量PCR快速检测对虾白斑综合症病毒

根据对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和Taqman探针,建立了WSSV的实时定量PCR检测体系.构建含有WSSV目的扩增片段的质粒为标准品,进行定量PCR扩增,结果表明标准品浓度在1.5×107～1.5×101个拷贝之间有"S"型扩增曲线,检测限为15个拷贝.标准曲线中模板浓度(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.77 lgX+43.73,相关系数R2=0.9967.该检测方法特异性强,对传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、肝胰腺细小病毒(HPV)以及对虾基因组DNA没有扩增反应.运用该方法对100尾对虾样品进行检测,14个对虾样品为阳性.而运用巢式PCR检测只有4个对虾样品为阳性.实时定量PCR方法检测WSSV,快速、特异、灵敏,在虾病的临床检测上具有重要意义.     

鸭三种病毒性疾病多重PCR检测方法的建立及初步应用

为了一次性检测临床样品中是否存在鸭新城疫病毒(NDV)、鸭瘟病毒(DPV)或鸭坦布苏病毒(DTMUV)感染,本研究根据GenBank已登录的3种病原的保守基因序列,分别设计了3对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了可同时检测NDV、DPV和DTMUV的多重PCR检测方法。特异性检验表明,该多重PCR方法可同时扩增出NDV(510bp)、DPV(400bp)、DTMUV(300bp)的特异片段,对其他鸭常感染病毒扩增结果均为阴性;敏感性测定表明,该多重PCR技术最低能检出1.02×10~4拷贝·μL~(-1) NDV、3.50×10~3拷贝·μL~(-1) DPV和1.17×10~4拷贝·μL~(-1) DTMUV。采用建立的多重PCR方法对250份临床样品进行检测结果显示,其检测结果与该3种病毒的常规单一PCR检测结果符合率为100%。以上结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法具有快速、特异性强、敏感性高等优点,适用于临床样品中上述3种病原的检测。     

基于微流控芯片电泳的番茄黄化曲叶病毒快速检测

【目的】探索微流控芯片电泳方法在PCR产物检测方面的效果,并建立针对番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）的微流控芯片电泳检测方法,弥补琼脂糖凝胶电泳方法在试剂消耗、所用时间、安全性方面的缺陷。【方法】通过对TYLCV的基因组进行分析后,在该基因组中相对稳定的位置设计引物,同时兼顾引用已被研究者研究过的引物,对这些选择的引物进行特异性、稳定性、灵敏度等方面的验证,筛选出用于后续试验的引物。选择DNA标准物φX174/BsuR I(Hae Ⅲ) marker,分别进行琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片电泳,对二者在耗材、耗时和灵敏度方面进行比较,确定微流控芯片电泳在核酸检测方面的应用价值。利用筛选出的其中1对引物对番茄叶片的实际样品进行PCR扩增,随后通过微流控芯片电泳对其进行检测,以此探讨微流控芯片电泳在病毒检测方面的检测效果。【结果】共筛选出14对TYLCV备用引物,其中2对引自文献,12对为本文设计,每对引物均可满足微流控芯片检测要求。选择其中1对引物TYLCV-T作为随后的研究对象。利用琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片电泳对DNA标准物检测,结果表明微流控芯片电泳在耗时方面不足琼脂糖凝胶电泳的1/10,约为13 min,试剂消耗为琼脂糖凝胶电泳的1/8,检测灵敏度方面至少比琼脂糖凝胶电泳高103倍,根据DNA标准物原液浓度计算可知,微流控芯片电泳至少可准确检测到浓度为5×10-6 μg?μL-1的核酸样品。利用微流控芯片电泳对TYLCV-T扩增的TYLCV PCR产物进行检测,将检测峰值图与DNA标准物的峰值图时间比较,就可判断出产物峰的大小范围。【结论】筛选出的关于TYLCV的备用引物可作为进一步研究微流控芯片技术在该病毒检测方面的基础;通过将琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片电泳进行比较,确立了后者在核酸检测方面的应用价值;通过微流控芯片电泳对TYLCV PCR产物的检测,建立了基于微流控芯片电泳的TYLCV快速检测方法,为TYLCV的快速检测提供新的技术支持。     

LAMP和巢式PCR检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的比较

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是克氏原螫虾(Procambarus clarkii)养殖生产中危害最大的病原之一,也是其他一些要经济虾类的主要病害,但是目前没有相应的有效治疗药物.为了减少WSSV对克氏原螯虾的危害,及早发现病原,以便采取相应措施将损失降到最小程度,笔者开展了以环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法检测克氏原螯虾WSSV的研究,并且与灵敏度非常高的巢式PCR检测法进行了比较.结果表明,用LAMP法可以快速、灵敏、特异性地检测克氏原螫虾WSSV,其灵敏度与巢式PCR相比,高出约500倍,且不需要专用的PCR仪,是检测WSSV的一种理想方法.该结果也为其他虾类的WSSV检测提供了重要参考.     

基于HSP60基因哈氏弧菌PCR检测方法的建立

研究基于哈氏弧菌HSP60基因序列设计1对特异性引物,通过优化PCR条件,特异性及敏感性检测,建立了一套哈氏弧菌特异性PCR检测方法.结果表明,该PCR检测方法可使分离自患病南美白对虾的哈氏弧菌扩增出238 bp的HSP60基因片段,其他五种对照病原弧菌未扩增出任何条带;检测方法最低能检测出2.1 pg的哈氏弧菌基因组DNA.表明建立的哈氏弧菌PCR检测方法可用于该菌引起的水产动物疾病的快速诊断.     

南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测体系的建立

养殖对虾可混合感染多种病毒,桃拉病毒(Taura syndrome virus,TSV)和白斑病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是南美白对虾感染的主要病原体,建立TSV和WSSV的多重聚合酶链式反应(PCR)技术可有效防制疫病的爆发。根据GenBank公布的TSV和WSSV全基因组序列,分别设计TSV和WSSV的特异性引物,并在四种不同的PCR系统中扩增筛选,在同一电泳道内得到与预期结果相符的、可明显区分的2条特异条带,PCR扩增产物测序显示分别与TSV和WSSV基因序列吻合,本体系的建立为生产鉴别和诊断混合感染病毒奠定基础。     

白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp（WSSV）和168 bp（血卵涡鞕虫）,与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

致对虾肝胰腺坏死病副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种对虾急性肝胰腺坏死病（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease）病原菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND）荧光定量 PCR 检测方法,对该病进行快速检测。【方法】根据副溶血弧菌基因保守序列设计特异性引物和探针,经优化反应体系及条件,建立检测 VpAHPND 的荧光定量 PCR 方法;以重组质粒为标准品制作标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】该方法定量范围宽,起始模板浓度范围为 2.3×101 ~2.3×107 拷贝 /μL 时,标准曲线具有良好的线性关系;最低检测限为 2.3 拷贝/μL,与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应,重复试验变异系数为 0.45%~0.69%,可在 1 h 内完成样品检测;对临床对虾样品的检测结果表明,该方法与世界动物卫生组织（OIE）推荐的套式 PCR 法检测结果一致。【结论】应用 TaqMan 探针建立的检测 VpAHPND 的荧光定量 PCR 方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点,可有效用于临床对虾样品的 VpAHPND 检测。     

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)SWP2基因的克隆、表达及其在虾类病害检测中的应用

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是虾类养殖过程中一种非常重要的病原微生物.目前常用的EHP检测方法是以核糖体18S基因为靶基因的PCR检测,但由于18S基因的高度保守性,该方法存在一定的非特异性扩增问题.本研究利用电子克隆方法,得到了特异性较高的EHP孢壁蛋白2(spore ...     

血清4型禽腺病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立快速检测血清4型禽腺病毒病(Fowl aviadenovirus serotype 4,FAdV-4)的基于TaqMan探针的Quantitative real-time PCR(qPCR)检测方法，本研究根据Hexon基因序列，设计相关的qPCR特异性引物和探针，经特异性、敏感性和重复性试验以及反应程序等系列优化后，最终建立荧光定量检测方法并应用于临床样品的病原检测。FAdV-4的qPCR结果表明，优化后标准曲线决定系数(R²)为0.998,扩增效率(E)为95.226%,该方法效果良好。利用该方法，除FAdV-4外其他禽类常见病原均未检测到，该方法具有良好的特异性。该qPCR方法检出阳性的最低拷贝数为100个拷贝，而普通PCR方法检出阳性的最低拷贝数为10 000个拷贝，说明其具有良好的灵敏度。组内和组间变异系数均≤0.22%,该方法的重复性较高。对180份从江苏、安徽、江西和广西等省份采集的临床疑似样品进行检测，结果显示，qPCR方法检出率为51.1%,而普通PCR方法检出率为32.8%;同时基于qPCR引物的检出符合率为100.00%,而基于普通PC...     

凡纳滨对虾3种主要病毒和虾肝肠胞虫在辽宁地区的流行情况分析

为解决近年来辽宁地区凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei病害频发的问题,于2015年8月从辽宁省盘锦、营口地区26个发病的凡纳滨对虾养殖池塘中随机采集病虾样本,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)和对虾桃拉综合征病毒(TSV),并用环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplication,LAMP)技术检测虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)的感染情况。结果表明:IHHNV和EHP的检出率较高,分别为65.4%和34.6%,WSSV和TSV的检出率分别为19.2%和7.7%;EHP的检出率与对虾体型大小密切相关,在小虾样本中检出的阳性率高达100%,而大虾样本中均未检出;26份对虾样本中有7份样本同时携带EHP和IHHNV。研究表明,IHHNV和EHP是2015年8月辽宁地区凡纳滨对虾的主要流行病原,发病率可能与对虾生长缓慢、个体大小差异明显相关。     

白斑综合征病毒单克隆抗体的制备及BA-ELISA方法的建立

白斑综合征病毒(white spot syndrom virus,WSSV)是甲壳类动物的重要病原,作者采用提纯的WSSV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,共得到3株能特异分泌抗WSSV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞(1E9、1E10、4F5)。将3株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶104~105。1E9、4F5的抗体亚型均为IgG1,1E10的抗体亚型为IgG2b。特异性实验表明:3株单抗与虾类病原桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、哈维氏弧菌(V.harveyi)均无交叉反应。Western bolt分析表明:单抗1E9与病毒28kD外膜蛋白特异性结合。采用生物素标记纯化后的单抗1E9,并建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(Biotin-Adivin ELISA,BA-ELISA)用于WSSV的检测,该方法对提纯病毒的检测灵敏度约为4 ng,对病虾血淋巴的检测灵敏度达1∶25000。     

2013年浙江省南美白对虾虾苗病毒携带情况分析

病毒病频发是导致对虾养殖失败的最重要原因之一,为摸清浙江省南美白对虾虾苗病毒携带情况(白斑病毒、桃拉病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒),进一步提高水产苗种质量安全水平,于2013年对浙江省主要的南美白对虾虾苗场进行了病毒携带情况调查,并结合虾苗来源进行分析。检测方法采用国标、行标中的PCR或RT-PCR方法。结果显示,113份南美白对虾苗种来源均为外省,其中福建省58批次,广东省、海南省各26批次,其他地区3批次,共有68份检出病毒,总阳性率为60.18%,其中传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)阳性59份,占52.21%;白斑病毒(WSSV)阳性18份,占15.93%;桃拉病毒(TSV)阳性1份,占0.88%,WSSV和IHHNV同时阳性的10份,占8.85%。     

广东省南美白对虾豚鼠气单胞菌的分离鉴定

广东省某养殖场南美白对虾于2012年突发传染病,为确定该病病原并对其进行有效防制,特利用分子生物学技术对病原进行了分离鉴定。结果从发病南美白对虾分离纯化到1株优势菌ZHBX12016,将该菌人工浸浴感染南美白对虾,5 d后南美白对虾死亡率达95%,且发病对虾临床症状与自然病例相似,人工注射感染测得其半数致死量LD50为6.43×103cfu/mL。该菌革兰氏染色阴性,短杆状;对半乳糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖产气、精氨酸双水解酶,赖氨酸脱酸酶,葡萄糖酸盐的生化反应性与豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(synonym Aeromonas punctata)生化反应结果相同。用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增该菌16S rD NA序列进行测序和生物信息学分析,结果显示:分离菌株与豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)相似性达97.7%~100%之间,在系统发育树上聚为同一分支。综合该菌形态学、致病性、生理生化和16S rRNA基因分析结果,将其鉴定为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)。药敏试验结果表明分离菌株对氯霉素、土霉素、丁胺卡那、呋喃唑酮等高度敏感。