口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术，扩增出口蹄疫病毒（FMDV）VP2基因，并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞，获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后，感染sf9细胞，表达VP2融合蛋白，分子质量为33ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体，通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定，说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达，且可以与牛抗。型FMDV血清发生特异性反应。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及免疫原性检测

将口蹄疫病毒VP1基因克隆至原核表达载体pBAD／TOPO中，经鉴定后得到了重组质粒pBAD-VP1。将此重组质粒转化到受体茵TOP10中，分别以不同浓度的诱导剂L-阿拉伯醛糖进行诱导，并在不同诱导时间进行采样，经处理后做SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。结果，以终浓度为0．02g／L的L-阿拉伯醛糖进行诱导，4h后表达可达到高峰，表达产物大小约为40ku。软件扫描结果显示，VP1融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的26．3％，能与抗FMDV抗体发生特异性反应，融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。抽提融合蛋白的包涵体，经过洗涤后制成油乳荆疫苗，经皮下注射免疫豚鼠，用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数，并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒。结果表明，用此融合蛋白的包涵体免疫豚鼠能诱导产生中和抗体，并对病毒的攻击提供免疫保护。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核可溶性表达

针对重组原核表达载体表达目的蛋白以包涵体形式存在的问题,作者对影响外源蛋白表达的IPTG的浓度、温度、时间等因素均进行了探索.以观察VP1蛋白的可溶性情况.通过PCR技术将VP1基因克隆至pGEM-T载体中,然后将pET-28a(+)和pGEM-T载体分别进行双酶切.构建重组的pET-28a-VP1载体,将重组载体转化至BL21中,诱导后经SDS-PAGE检测可见约29 ku的目的蛋白条带.插入的外源目的蛋白主要以包涵体的形式存在,上清中的可溶性蛋白甚微.试验结果表明,这可能与蛋白本身的氨基酸组成有重要关联.     

鹅细小病毒NS2基因的原核表达及抗原性检测

为原核表达鹅细小病毒(GPV)NS2蛋白,本研究利用特异性引物扩增获得GPV的H1分离株NS2基因,将其克隆于pMD18-T载体后进行序列测定。并将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-NS2。该质粒转化于感受态菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为75ku左右。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白。Westernblot和Dot-ELISA鉴定结果表明,表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。     

O型口蹄疫病毒VP1基因在2种原核表达载体上的表达

设计1对引物将口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)VP1基因克隆到T载体上,通过NdeⅠ和Xho Ⅰ双酶切VP1基因和pET-28(a),在T4连接酶的作用下构建重组表达载体pET-28a-VP1;然后用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切VP1基因与pET-41(a),在T4连接酶的作用下构建重组表达载体pET-41a-VP1;然后将这2个新构建的载体分别通过热冲击法转化BL21(DE3),37℃不同IPTG浓度和32℃、0.01 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示pET-28a-VP1的表达量高于pET-41a-VP1,在DTT和乙醇的作用下,二者均没有可溶性蛋白出现.     

水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及鉴定

采用PCR技术扩增MEV VP2基因,将该基因片段定向克隆原核表达载体PET-30a,构建MEV VP2基因原核表达重组质粒PET-30a-VP2。将该重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDSPAGE和Western-blotting分析。结果表明:该基因全长1 755 bp,其目的基因序列完全正确,能编码584个氨基酸。利用载体上的His标签对其进行纯化,经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白以包涵体的形式存在,大小约为70 ku;Western-blotting验证该重组蛋白具有被抗MEV血清识别的特性,具有良好的反应原性,可为MEV基因工程亚单位疫苗、免疫学诊断方法等提供参考。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白,用于O型口蹄疫病毒的检测.以质粒T234/FMDV为模板,PCR扩增VP1基因片段,构建重组质粒pET-41b/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot进行分析检测,目的蛋白经镍离子亲和层析纯化,以纯化的目的蛋白包被,建立了间接...     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank上发表的犬细小病毒（CPV）VP2蛋白基因序列，设计并合成1对引物，通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET一30a载体中，构建了原核表达载体pET—VP2，转化大肠杆菌Rosetta，表达并纯化了重组蛋白，Western—blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原，通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15．8ng／孔，血清的最佳稀释倍数为1：100，建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。     

O型口蹄疫病毒VP1嵌合基因的构建及原核表达

首先合成我国O型口蹄疫病毒2个疫苗毒株VP1基因的3个抗原袁位，与另外扩增的流行毒株VP1基因末端273bp片段相连,构建出O型VP1嵌合基因片段（VP1O）。然后，将VPIO基因连接到原核表达载体pET28a上，构建了重组表达质粒pET28a-VP1O，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达。SDS-PAGE电泳表明。VP1O基因在大肠杆菌中获得表达。Western blotting检测证实表达的VP1O蛋白具有良好的生物学活性。对表达蛋白通过包涵体洗涤的方法进行初步纯化，获得了较高纯度的VP1O蛋白。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及重组蛋白的纯化

利用PCR技术扩增获得C型口蹄疫病毒VP1基因,将其克隆到原核表达载体pET-30α(+)上,构建重组表达质粒pET-VP1。质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE、Western blot分析,结果得到分子量约为33 ku的目的条带,表达产物占菌体总蛋白的35%,且该目的条带能被C型FMDV阳性血清识别,说明VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达。融合表达蛋白经镍柱纯化,重组蛋白纯度达90%以上。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT—PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因，将其插入pMDl8-T载体进行序列分析，结果表明，所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物，以重组pMD-T—VP1阳性质粒为模板，扩增获得了VP1基因，通过酶切将其克隆至表达载体pQE—Trisystem上。经测序证实，重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE—VP1转化至大肠埃希氏菌M15，通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达，SDS—PAGE和Western—blot分析表明，表达产物大小与预期的结果（26ku）一致，且具有良好的反应原性。以2mmol／LIPTG诱导表达5h时表达量最高，其中70％～80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中，表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

猪口蹄疫病毒多抗原表位的原核表达与纯化

利用限制性酶切从重组质粒pShuttle-CMV-VP中得到猪O型口蹄疫病毒VP1(21-60)-(141-160)-(200-213)位氨基酸的基因。将此多抗原表位基因克隆至原核高效表达载体pET43.1 a(+),在E.coliBL21中用IPTG诱导表达了含有猪口蹄疫病毒多抗原表位的融合蛋白,并用镍柱亲和层析法获得了纯化蛋白。W estern-b lot结果表明融合蛋白可被猪O型口蹄疫病毒标准阳性血清所识别,从而为进一步研究FMDV多表位抗原的免疫特性和诊断方法奠定了基础。     

蓝舌病病毒VP7基因的原核表达

为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因的原核表达蛋白,本实验采用RT-PCR方法扩增出了血清1型BTV的VP7基因,并克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,构建了重组质粒pMAL-VP7.将重组质粒转化TBl感受态细胞,以0.5 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白MBP-VP7以可溶形式存在,分子质量约为90 ku.以纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立了检测BTV血清抗体的间接ELISA诊断方法,为今后进一步开展BTV诊断研究奠定了基础.     

IBDV H1株VP2基因的原核表达及其产物的复性

应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1461bp的VP2基因，将其克隆于pET-28a载体，筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导，在其宿主菌BL21（DE3）中成功表达了53．7ku的蛋白，SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示，VP2表达产物以包涵体形式存在，可与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。将VP2表达产物进行纯化和复性，用复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA检测，结果，复性后蛋白的反应活性比复性前增强了10倍；用复性后的蛋白与IBDV单抗进行Dot-ELISA，结果显示，VP2蛋白与单抗1H4、1E12、583、EA6、3c7反应强（＋＋＋）；与4E4、1H11反应中度（＋＋）；与4E5、3C4、1E11、3H9反应较弱；而与EC6、3D12、1A1无反应。     

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2、VP1和VP2-VP1串联基因的原核表达及其初步应用

为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。     

基因C型鸭甲肝病毒VP1基因的克隆及原核表达

为原核表达基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1重组蛋白,本研究通过设计套式PCR引物,RT-PCR扩增DHAV-C VP1全基因,约为720 bp,将其亚克隆至pET-32a(+)载体中构建重组表达质粒pET-VP1。将其转化E.coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达了约47 ku的重组蛋白。Western blot分析表明,该重组蛋白可以与兔抗DHAV-C阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。