伊氏锥虫对杀锥虫药抗性的体外试验

伊氏锥虫对杀锥虫药抗性的体外试验涂洁贵摘译沈永林校１引言随着锥虫病流行地区的抗寄生虫药物广泛应用,开发新的抗锥虫药物来防止抗性的发生尤为紧迫。然而制药厂家对投资开发抗锥虫药兴趣甚微。使今后引进新药明显不可能,因此必须致力保持现有杀锥虫药的效果。在癌症...     

伊氏锥虫、马媾疫锥虫、布氏锥虫、刚果锥虫的18S rDNA部分序列测定与系统发育关系

对伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）：新疆株（XJCA）、湖北株（HBM）、云南株（YNB）、广东株（GDB2）；马媾疫锥虫（Trypanosoma equiperdum）、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）、刚果锥虫（Trypanosoma congolense）提取基因组DNA，根据已报道的伊氏锥虫株18SrDNA基因序列设计合成引物，用PCR扩增了锥虫虫株基因组DNA,伊氏锥虫新疆株、湖北株、云南株、广东株、布氏锥虫、刚果锥虫均为373bp的片段；马媾疫锥虫为372bp的片段，PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化，纯化后PCR产物经连接、转化后测序，将测得的序列用DNAMAN软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较，并绘制了系统发育进化树。结果与国外AJ009153、AJ223564、D89527株同源性达到99％～100％，与另外11株同源性75％。本研究为锥虫分子流行病学研究及分类研究打下基础。     

关于伊氏锥虫低温保存的研究

低温冰箱保存虫种可以代替传统的动物接种方法。以甘油作防冻剂,1640小牛血清作营养液,-80℃低温冰箱冷冻保存伊氏锥虫至一年,仍保持原有的浓度及毒力,接种小白鼠后第3天出虫,第6天死亡。     

伊氏锥虫抗原变异规律

国内外已有众多文章报道了伊氏锥虫表面抗原变异现象的特点，但均较零散，本文将这些报道进行分析综合，从中找出共同点，归纳出伊氏锥虫抗原变异的一些规律，计有伊氏锥虫抗原变异的频率、抗原变异的程序、变异体的数量、优势变异体和非优势变异体，伊氏锥虫感染动物后第一次发生抗原变异的时间和特点等，作者并对尚需继续探索的有关规律性的研究内容也提出了看法。     

伊氏锥虫感染力及其毒力的比较试验

伊氏锥虫是家畜主要的致病锥虫。不但感染众多的宿主,而且地理分布也十分广泛.其感染力及毒力因地理和宿主条件的不同而表现出差异.宿主中以马、大和大小鼠等为高度易感动物,感染后往往发病急、死亡快,而牛、兔和豚鼠等动物则较差,其感染呈慢性经过.我们通过小鼠及豚鼠人工感染试验对伊氏锥虫云南株和广东株的感染力及其毒力进行了比较观察。     

伊氏锥虫TR酶的初步研究

国外研究者已报道在布氏锥虫、枯氏锥早、刚果锥虫中发现了存在ＴＲ酶，此酶是锥虫代谢的重要酶之一。伊氏锥虫ＴＲ酶研究的尚属空白。本研究目的是为了确定伊氏锥虫中是存在ＴＲ酶。我们利用分光光度法测出了伊氏锥虫中有ＴＲ酶活性，但无ＧＲ酶活性，测出了ＴＲ酶的Ｋｍ和Ｖｍ值；发现了治疗锥虫药物安锥赛和盐酸锥双对ＴＲ酶有抑制作用，抑制率分别达２８％和３１％；比较了七株中国伊氏锥虫和布氏锥虫敏毫克蛋白中ＴＲ酶活力，其     

弓形虫,泰氏锥虫和伊氏锥虫超低温冷冻保存的试验研究

根据液氮(-196℃)超低温冷冻保存组织细胞的原理,本文选用Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ号保护剂分别对来自体外培养的弓形虫和泰氏锥虫、小鼠血液内的伊氏锥虫以及小鼠腹腔液内的弓形虫进行超低温冷冻保存试验。试验表明,在没有特殊逐步降温设备的情况下,直接冻存法比间接冻存法更方便,效果更为确实。截至报道之日止,弓形虫保存已达954天,泰氏锥虫达1189天,伊氏锥虫达1089天,虫体形态、活力、增殖力和致病性均无明显改变,为虫体的长期保存提供了一较为简便可靠的方法。     

伊氏锥虫对安锥赛抗药性的分子基础初探

为了探讨伊氏锥虫对安锥赛抗药性的分子基础，将伊氏锥虫单虫克隆，一部分克隆虫通过28只免疫抑制小白鼠，用安锥赛亚治疗剂量治疗，使其产生抗药性，为抗药锥虫；另一部分克隆锥虫也通过28只免疫抑制小白鼠,，但不用药物治疗，为敏感锥虫，即对照，用体外生长抑制法测得抗药和敏感锥虫的IC50分别为43．8和0．16878μg/ml。分别提取它们的总RNA和mRNA，总RNA分离出3条带，即从电泳的阴极到阳棚分别为26s,21s和5s,mRNA主要分布在21sRNA之后。用抑制性消减杂交法，以敏感锥虫的cDNA为试验组（Tester)，抗药锥虫的cDNA为驱动组（Driver)，共挑选出34个阳性克隆，以cDNA来合成探针，用Southern dot blot鉴定，其中18个片段所在的基因是由于抗药性产生而表达量降低，这18个片段长度为300－700bp。     

伊氏锥虫与小鼠细胞的粘附反应研究

本文探讨了伊氏锥虫在体外与小鼠淋巴细胞、巨噬细胞和上皮细胞间的粘附反应。结果表明，三种健康细胞与锥虫有不同程度的粘附性，不同个体来源的细胞的粘附反应存在差异，但是，各类细胞的粘附率之比基本稳定。动物受到感染后，粘附细胞数大幅度减少。人α－干扰素可以促进健康细胞以及受感染动物细胞与锥虫的粘附性。细胞粘附水平高的个体在疾病的后期表现有较强的耐受力。作者认为，小鼠多种细胞表面存在着伊氏锥虫的病原性受体，后者与动物的抗锥虫感染能力以及疾病发生都有明显相关性。     

理化因素对体外培养伊氏锥虫致弱的影响

本试验观察了理化因素（γ－射线、紫外线、低浓度杀虫药）对体外培养伊氏锥虫致弱的影响，结果如下：受γ－射线辐照的伊氏锥虫开始时存活数随辐照剂量的增加而减少，随后表现出无规律性，辐照剂量５万ｒａｄ以下对锥虫的存活影响较小，５～１０万ｒａｄ辐照后２ｄ锥虫的存活数明显减少，对小白鼠的感染性消失。伊氏锥虫受紫外线照射的存活曲线为“Ｃ”型，群体抗辐射不均一，平均致死剂量（Ｄ＿（３７））为波长２６５０Ａ的２０Ｗ紫外灯离样品４０ｃｍ处照射约２ｈ。虫体照射后根据体外跟踪观察，其存活数随照射剂量的增大而减少，照射了３ｈ和４ｈ第３天的活虫数近似１００条或不足１００条，对小白鼠的感染性均消失。用０．１μｇ／ｍｌ的苏拉灭和０．８μｇ／ｍｌ的贝尼尔两种低浓度杀虫药在体外对伊氏锥虫诱导４０ｄ仅造成药敏性的改变，未造成毒力减弱。     

RT-PCR法分离伊氏锥虫VSG基因的研究

应用异硫氰酸胍一酚一氯仿一步法分离伊锥虫安微株克隆虫体ＳｈＴａｔｌ的二信抗原变异体ＳｈＴａｔ１．３和ＳｈＴａｔ１．５总ＲＮＡ，在含有甲醛物琼脂糖凝胶电泳后，转印到硝酸纤维膜上。根据布氏锥虫ＶＳＧｍＲＮＡ３’端保守序列，设计合成了一个互补于它的含十八个碱基的寡核苷酸５’－－ＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＧ－３’，经＾３２Ｐ标记，Ｎｏｔｒｈｅｒｎ杂交，首次证明２伊氏锥虫含有同样的保守序列。利用合成的十     

伊氏锥虫同工酶、蛋白质和抗原组分的比较研究

本文采用生化技术对八个中国伊氏锥虫株及一个布氏锥虫株的同工酶、蛋白质和抗原组分进行比较研究。根据同工酶电泳结果,可将伊氏锥虫和与其形态上不能区分的布氏锥虫区别开来,亦可将伊氏锥虫分为两个酶株群(Z1、Z2)。根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和免疫印迹试验的结果,可将酶株群Z1分成五个不同多肽群(株)。本研究结果表明,中国伊氏锥虫遗传变异程度较低,是一个相对稳定的种群。     

用毛细管电泳检测伊氏锥虫微环DNA PCR扩增产物

毛细管电泳技术用于ＤＮＡ电泳分析,具有快速,样品用量少,高重复率等特点。本文应用毛细管电泳对动基体微环ＤＮＡ ＰＣＲ扩增产物进行检测,结果表明扩增产物分子量片段为３００ｂｐ到６００ｂｐ之间,与实验设计相符,且比较纯净,可用于下一步测序分析。     

伊氏锥虫HGPRT缺陷株和自然株的HGPRT基因的分离、克隆与比较

参照布氏锥虫ＨＧＰＲＴ基因的核苷酸序列，设计一对引物，分别以伊氏锥虫ＨＧＰＲＴ缺陷株和自然株的总ＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，结果自然株出现６３０ｂｐ的ＤＮＡ条带，与设计大小一致，而缺陷株均为阴性，证明缺陷株的ＨＧＰＲＴ基因发生明显突变或缺失。自然株ＨＧＰＲＴ基因经与ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ连接，大肠杆菌转化，获得了阳性克隆。     

伊氏锥虫谷胱甘酰亚精胺还原酶（TR）的研究（二）

用ＣＥＡＥ ＤＥ－５２分离纯化的锥虫，经超声波粉碎后离心，上清经硫酸铵沉淀，再经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２００分子筛层析，ＤＥＡＥ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ＥＤ－５２离子交换层析，２’，‘ＡＤＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ层析得到纯化。筛选到抗蠕虫药奥芬哒唑（Ｏｘｆｅｎｄａｚｏｌｅ）对ＴＲ有抑制作用。但对治疗锥虫病没有作用；兔抗ＴＲ抗体与安锥赛共同注射人工感染锥虫病的小白鼠，可增加安锥赛对锥虫病的疗效。