鸡球虫毒力致弱方法及其在鸡球虫病弱毒活疫苗研发上的应用

鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种危害严重的肠道寄生原虫病,每年给全球养鸡业造成巨大经济损失。活疫苗是替代抗球虫药防控鸡球虫病的有效手段,而减毒活疫苗安全性能更高,免疫原性更好,更加稳定,有效防控鸡球虫病的暴发。通过理化致弱、鸡胚传代和早熟选育方法诱导虫株毒力减弱是常用的鸡球虫毒力致弱手段,但目前尚缺乏相关方法的系统性综述。鉴于此,为综合了解当前鸡球虫毒力致弱方法的研究进展及其在鸡球虫病弱毒活疫苗的应用研究,本文通过查阅、搜集和整理国内外文献相关研究内容,对鸡球虫强毒株致弱措施和方法及其在鸡球虫病弱毒苗应用现状进行综述,为新一代鸡球虫病弱毒活疫苗的研究提供理论依据。     

鸡球虫病弱毒疫苗的免疫机理及研究进展

鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种危害性极其严重的寄生原虫病,呈世界性分布,是最主要的鸡病之一。目前主要用抗球虫药物对其进行防制,但随着耐药虫株的产生和药物残留对肉禽品质及人体健康的影响等问题的出现,对鸡球虫活疫苗的研究成为研究热点。作者对鸡球虫弱毒疫苗的免疫机理及其鸡胚传代致弱方法、理化致弱方法和早熟选育致弱法的研究进展作一概述,并对鸡球虫弱毒疫苗的应用前景进行了展望。     

首个国产鸡球虫疫苗问世保护率超95％

佛山市正典生物技术有限公司自主研发的“鸡球虫病四价活疫苗（柔嫩艾美耳球虫PTMZ株＋毒害艾美耳球虫PNHZ株＋巨型艾美耳球虫PMHY株＋堆型艾美耳球虫PAHY株）”近日获得国家三类新兽药证书，这是国内首个全部采用早熟选育致弱的药物敏感虫株组成的鸡球虫病四价活疫苗。     

鸡球虫早熟株的生物学特性及其在疫苗中的应用

按照Jeffers建立的艾美耳球虫早熟株选育方法选育出的球虫早熟株，其潜在期明显缩短，繁殖力和致病性显著降低，但保持良好的免疫原性.并且，早熟株的弱毒性和早熟性具有遗传稳定性，通过放松选择压力反复传代后无恢复现象。国内外学者根据早熟株的这些生物学特性，并在深入了解鸡球虫病的保护性免疫机制的基础之上研制了抗鸡球虫病的早熟株弱毒活苗。本文综述了球虫早熟株的生物学特性，并介绍了目前国内外研制出的球虫早熟苗在鸡球虫病防治方面的应用。     

ELISA检测DLV虫苗免疫鸡抗体消长规律的研究

将柔嫩、毒害、巨型艾美耳球虫的孢子化卵囊制成可溶性抗原，用酶联免疫吸附试验检测鸡球虫双重致弱多凤苗虫苗、为柔嫩、毒害、巨型艾美耳球虫三价苗免疫鸡血清抗球虫抗体的消长规律。     

鸡柔嫩艾美耳球虫早熟耐药株的放松传代及其特性研究

为了进一步验证鸡柔嫩艾美耳球虫早熟耐药株经本动物(鸡)连续传代后的毒力和遗传稳定性,为虫种种子传代提供依据,试验对鸡柔嫩艾美耳球虫早熟耐药株(Etpp)用11日龄敏感鸡连续放松传代10次,其潜隐期、排卵囊高峰、卵囊产量、致病性和免疫原性均保持了早熟耐药株(Etpp)的特征,说明所选育的虫株(Etpp)在遗传上具有稳定性。     

柔嫩艾美耳球虫早熟株的内生发育及其致病性

为了给鸡球虫早熟弱毒疫苗的开发提供依据,对柔嫩艾美耳球虫(Eim eria tenella) 北京株经10 代早熟选育获得的早熟株的内生发育研究发现,其第2 代裂殖生殖发育较快,第2 代裂殖体含裂殖子较少,提前进入配子生殖,从而造成卵囊“早熟”。该早熟株致病性大大下降,经口感染10×104 个/只的致病性仅相当于剂量0.1×104 个/只亲本毒株的致病性。该虫株可作为研制早熟弱毒苗用虫株。     

用柔嫩艾美尔球虫早熟致弱虫株及其毒株对初生鸡雏和幼雏的免疫试验

自Jeffers于1975年首次用挑选早熟卵囊的方法获得柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)致弱虫株以来,人们又用同样的方法相继选育出7种鸡球虫的早熟致弱虫株,一种较为安全的全价抗鸡球虫病虫苗可望在不久的将来问世。现在面临的问题是设法找到一种最     

鸡和缓艾美耳球虫早熟虫株选育及其生物学特性研究

按照Jeffers1975年建立的艾美耳属球虫早熟虫株选育方法,对鸡和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）进行了单卵囊分离、扩增和早熟虫株的选育。经SPF鸡15代传代之后,分离株的潜隐期由96 h缩短至77 h,缩短了19 h。按索勋等1998年建立的方法对选育出的和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株（SY-mb77株）进行10代非选择性传代,证明该早熟虫株的潜隐期、卵囊产量、免疫原性和致病性均具备早熟虫株特性,并能有效抵抗强毒虫株的攻击。     

堆型艾美耳球虫早熟株与强毒株致病性和繁殖力的比较

为了比较堆型艾美耳球虫（E．acervulina）早熟株与强毒株的致病性和繁殖力情况,通过测定接种 E．acervulina 早熟株与强毒株后鸡只的精神状态、临床症状、增重、病变记分和卵囊产量,表明早熟株的排卵囊高峰出现在第5天,比强毒株提前1 d,早熟株的繁殖力是强毒株的85．8％;早熟株感染后对鸡只增重的影响较小,接种剂量在2．40×104个卵囊／羽之内时,相对增重率均大于90．0％,早熟株组鸡的肠道病变记分显著低于同剂量的强毒株组的肠道病变记分（P ＜0．05）。由此认为,该早熟株符合球虫早熟株的低致病性特性,可用于鸡球虫病早熟苗的制备。     

堆形艾美耳球虫早熟株选育及相关生物学特性研究

为了选育堆形艾美耳球虫（Eimeria acervulina）早熟株及观测其生物学特性,运用Jeffers创立的艾美耳属球虫早熟株选育方法,对实验室保存的堆形艾美耳球虫进行连续传代早熟选育,并对获得的早熟株与母株孢子化卵囊大小、繁殖能力、致病性以及免疫保护力等指标进行了测定,比较堆形艾美耳球虫早熟株与母株之间的基本生物学特性差异。经过18代早熟选育后,堆形艾美耳球虫的潜在期由母株的99h缩短至84h。与母株相比,早熟株的孢子化卵囊大小明显减小（P〈0．05）,卵囊繁殖能力降低了17％～42%。致病性试验中,早熟株感染组的平均增重均高于母株,而病变记分相当。免疫保护试验中,早熟株与母株的免疫保护力相当,其卵囊抑制率略低于母株,差异不明显（P〉0．05）。结果表明,本研究成功选育出堆形艾关耳球虫早熟株,对母株攻击具有保护力,为鸡球虫疫苗的研制奠定了基础。     

堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)早熟株与毒株的繁殖力和致病性比较试验

对经15代选育的堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)北京株的早熟株与其毒株的繁殖力和致病性进行了比较研究，证实早熟株的潜隐期比毒株缩短27h，繁殖力有所下降；对致病性的研究显示，早熟株感染后对鸡只增重的影响较小，而且肠道病变记分亦较毒株下降。由此认为，该早熟株符合球虫早熟株的基本生物学特性，适宜用于鸡球虫病早熟苗的制作。     

巨型艾美耳球虫山西早熟株诱导及生物学特性研究

本研究采用早熟选育技术，诱导选育出1株与已获得的山东株免疫原性差异较大的巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)山西株的早熟弱毒株，并对其进行生物学特性研究。结果表明：早熟诱导获得的巨型艾美耳球虫山西早熟株卵囊略小于亲本株，潜隐期为109 h;早熟株各组小肠病变记分差异显著低于(P<0.05)亲本株组，且临床症状较亲本株组弱；等剂量下，早熟株组的卵囊产量及卵囊繁殖力低于亲本株组；早熟株单次免疫剂量≥400个卵囊/只、2次免疫的一免剂量≥100个卵囊/只、二免剂量≥200个卵囊/只时可达到良好免疫效果。本研究结果为制备高效广谱、免疫原性良好的鸡球虫疫苗提供虫株和理论依据。     

陕西省杨凌区柔嫩艾美耳球虫早熟株选育及致病性研究

采用球虫早熟系虫株选育的方法,反复收集感染后最先排出的卵囊,选育出杨凌地区鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株并对早熟株的潜伏期、致病性及繁殖能力进行了研究。结果表明,经18代选育的鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌早熟株的潜伏期比母株缩短了24h;早熟株卵囊的形态与母株相似,但没有母株卵囊的大;早熟株的繁殖能力低于母株,每羽鸡所排卵囊总量与剂量呈正相关,而每个卵囊的繁殖能力与剂量呈负相关;早熟株的致病性低于母株。     

陕西省杨凌区柔嫩艾美耳球虫早熟株选育及致病性研究

采用球虫早熟系虫株选育的方法,反复收集感染后最先排出的卵囊,选育出杨凌地区鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株并对早熟株的潜伏期、致病性及繁殖能力进行了研究。结果表明,经18代选育的鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌早熟株的潜伏期比母株缩短了24h;早熟株卵囊的形态与母株相似,但没有母株卵囊的大;早熟株的繁殖能力低于母株,每羽鸡所排卵囊总量与剂量呈正相关,而每个卵囊的繁殖能力与剂量呈负相关;早熟株的致病性低于母株。     

鸡艾美耳球虫哈尔滨株的分离与鉴定

为研究鸡艾美耳球虫哈尔滨株单一虫种的生物学特性,本研究利用单卵囊分离技术分离了6种鸡艾美耳球虫哈尔滨株,用分离的单卵囊接种雏鸡,同时应用PCR方法对收集的单卵囊分离株进行球虫种类鉴定并进行同源性和系统进化分析.结果显示,分离得到的6株鸡艾美耳球虫分别为柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫,PCR结果表明单卵囊分离株确为该6种纯株.本研究表明毛细吸管单卵囊分离法简便易行,使接种难度降低,提高了接种成功率,为球虫的分子生物学研究奠定了基础.     

巨型艾美耳球虫免疫对其它几种球虫的血清学反应和临诊抗感染交叉保护力的研究

为探讨鸡艾美耳球虫种间交叉免疫这一尚有争议的问题,本文用ELISA方法检测了巨型艾美耳球虫（Eimeriamaxima）免疫血清与其它主要虫种（柔嫩艾美耳E．tenella、毒害艾美耳E．necatrix及堆型艾美耳球虫E．acervulina）抗原的血清学反应,同时观察了E．maxima免疫（1×104个卵囊/只）鸡遭受上述虫种大剂量（1×105个卵囊／只）强毒攻击后的死亡率和肠道病变,对临诊交叉保护力进行了评估。结果表明,E．maxima免疫血清与E．tenellaE．acervulina可溶性抗原有不同程度的交叉反应;E．maxima免疫后用E．tenella,E.acervulina,E.necatrix大剂量强毒攻击,分别有70％、40％、6％的鸡获得了完全保护;25％、60％、27％的鸡获得了部分保护。     

球虫疫苗研究进展

本文对疫苗类型、疫苗的研制方法、展望三个方面进行了阐述。其中,疫苗类型有强毒活疫苗、弱毒活疫苗、灭活疫苗、基因工程苗等。疫苗的研制方法,强毒活疫苗主要通过控制球虫卵囊量,弱毒疫苗的致弱方法有鸡胚传代致弱、早熟选育致弱、物理和化学方法致弱。     

毒害艾美耳球虫早熟株与亲本株繁殖力的观察

为选育毒害艾美耳球虫(E.necatri)早熟株,了解其繁殖力,为早熟弱毒活苗的研制奠定基础,本试验运用球虫的单卵囊分离技术得到一株E.necatrix(P0),并对其进行了早熟选育,得到了E.necatrix早熟株P8。P0和P8分别以0.05×104、0.1×104、0.5×104和1×104个/只的剂量接种11日龄雏鸡,接种后第7～13天每天检测粪便中的卵囊产量。结果表明,P0与P8均为接种0.5×104个/只的卵囊产量最大;P8的繁殖力是P0的55%;P8的卵囊高峰期较P0有提前趋势。     

和缓艾美耳球虫保定株早熟系的选育及生物学特性研究

按照Jefiers 1975年建立的艾美耳球虫属球虫早熟选育方法,对和缓艾美耳球虫保定株进行了早熟选育。通过连续11代的早熟选育后,获得了潜隐期由97h缩短至82h的早熟系。该早熟系经过5代连续非早熟选择性传代,潜隐期仍稳定在82h。排卵囊期为感染后第4~10天,其中第5天为高峰期。该早熟系的致病力较亲本株弱,同样剂量感染后早熟系感染组相对增重率显著高于亲本株感染组。该早熟系免疫原性良好,每羽鸡免疫100个以上卵囊即可较好抵抗1x10^5个亲本株的攻击,相对增重率达80.0%以上和卵囊减少率达90.0%以上。