朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的表达纯化及其酶活测定条件优化

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是生物体内保证神经信号正常传递的关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标。现研究拟采用发酵罐培养含pET-30a/ace的表达菌株E.coli BL21(DE3),大量表达纯化螨AChE,利用单因素试验和正交试验优化AChE活性的测定条件。结果表明:发酵培养的重组菌株大量表达约为68kD的朱砂叶螨AChE蛋白。底物浓度、温度、pH和酶浓度等各测定因素对朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性存在显著影响。确定朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性测定的最佳反应条件为:底物浓度1mmol/L,pH值7,温度35℃,酶浓度0.5mg/mL。通过体外发酵培养纯化获得了大量的朱砂叶螨AChE重组蛋白,确定了螨AChE活性测定的最佳条件,为进一步研究其酶学性质以及AChE抑制剂的体外筛选奠定基础。     

星豹蛛乙酰胆碱酯酶活性测定条件的优化

为了进一步研究星豹蛛乙酰胆碱酯酶的生物活性,利用正交试验研究了反应体系的pH值、反应时间、酶浓度、反应温度和底物浓度5个因素对测定星豹蛛(Pardosa astrigera L.Koch)头胸部乙酰胆碱酯酶活性的影响,以优化酶活性测定的最适条件。对试验结果进行极差和方差分析,确定了星豹蛛头胸部乙酰胆碱酯酶的最适反应条件是:酶浓度为12 g.L-1;底物浓度为0.6 mmol.L-1;反应体系pH值为7.0;反应温度为30℃;反应时间为5 min。     

落叶松毛虫AChE 最佳反应体系建立及其 对3 种杀虫剂敏感性比较

通过正交试验和酶活性测定法研究了落叶松毛虫6 龄幼虫乙酰胆碱酯酶(AChE)最佳反应体系及对3 种杀 虫剂的敏感性。结果表明:落叶松毛虫6 龄幼虫AChE 最佳反应条件为酶液质量浓度0郾2 g/ mL、底物浓度0郾8 mmol/ L、反应体系pH 7郾5、水浴温度35 益和反应时间5 min。敌敌畏、高效氯氟氰菊酯和阿维菌素对落叶松毛虫6 龄幼虫体外AChE 活性产生不同的抑制作用,且抑制效应与杀虫剂呈现明显的剂量鄄效应关系;其中敌敌畏抑制效 果最显著(IC50 =3.018 ·10 -4 mg/ mL),其次是高效氯氟氰菊酯(IC50 = 1.436 ·10 -2 mg/ mL),而阿维菌素对AChE 活性抑制效果最弱。      

家蝇乙酰胆碱酯酶的纯化、生化性质及其对杀虫剂敏感性的研究

采用CEA亲和层析法对家蝇AChE进行纯化,测定了不同温度、pH值、ATChI浓度、DTNB浓度对AChE活性的影响,并测定了不同杀虫剂对纯酶和粗酶的抑制作用.结果表,CEA纯化倍数为672.36,产率为34.68%;当温度为35℃时,粗酶和纯酶的AChE活性最高;当pH=7.2时,纯化后AChE的活性最高,随后随着pH的升高AChE的活性反呈下降趋势;当pH=7.8时,粗酶AChE活性最高;当底物浓度的2 500 umol·L-1时,纯化AChE活性达到最大值,当底物浓度为l 500 μmol·L-1时,粗酶活性达到最大值;粗酶和纯化的AChE活性的两个波峰出现在DTNB浓度为0.2 mol·L-1和0.4 mol·L-1时;仲丁威、乙酰甲胺磷、速灭威、甲胺磷、毒死蜱、克百威、抗蚜威、灭多威和辛硫磷等9种杀虫剂对粗酶和纯酶AChE的IC50比值都大于6,甲萘威对纯酶和粗酶AChE的IC50比值为4.826,二嗪磷的为1.184,三唑磷的为0.099.     

复合蛋白酶水解大豆制备大豆肽工艺的研究

以大豆蛋白为底物,加入复合蛋白酶进行水解,对反应温度、底物浓度、反应时间、pH值、酶用量等工艺参数进行了系统地研究,并分析了大豆肽含量及大豆蛋白水解度与各影响因子之间的关系;研究结果表明:最适温度为30℃、最适pH值为5.5、最适底物浓度为4.5 mg/ml、最适加酶量为8%(W/V)、最适反应时间为5 h,在此条件下酶解液中可溶性蛋白含量为3.05 mg/ml、水解度为73.11%。     

舞毒蛾羧酸酯酶最佳反应体系的确立

为了确定舞毒蛾(Lymantria dispar)羧酸酯酶(Car E)活性的最佳反应体系,运用正交试验测定了反应体系中酶浓度、底物浓度、p H值、反应温度和反应时间5个因素对Car E活性的影响。极差分析和方差分析显示,舞毒蛾Car E的最优反应体系为酶浓度0.2头·m L-1,底物浓度0.2 mmol·L-1,p H=7.5,反应温度45℃,反应时间10 min。     

石榴果皮中多酚氧化酶测定最佳试验条件的确定

以陕西天红蛋石榴品种为试材,对石榴果皮中的多酚氧化酶(PPO)活性测定的最佳试验条件进行了初步研究,确定了其催化邻苯二酚氧化后产物的最高吸光度值,并分别研究了底物浓度、pH值、温度、反应后放置时间以及酶抑制剂浓度等条件对PPO活性的影响。结果表明:以邻苯二酚为底物时,底物浓度宜大于20mmol/L,其最适波长为420nm,最适pH值为6.8,最适温度为50℃,反应时间不宜超过20min,反应完成后在20min后测定PPO的活性最为稳定。抑制剂NaHSO4的有效抑制浓度为0.8mmol/L。     

丝瓜多酚氧化酶及过氧化物酶酶学特性的研究

应用分光光度法研究丝瓜多酚氧化酶及过氧化物酶酶学特性的影响因素,为丝瓜酶促褐变的研究提供基础。以普通丝瓜果肉为材料,PPO以邻苯二酚为底物,POD以愈创木酚为底物,研究分析反应温度、反应时间、pH及测量波长、底物的浓度、PPO提取酶液添加量对丝瓜PPO、POD活性的影响。丝瓜褐变相关酶提取和测定方法的优化:(1)PPO最佳反应体系:测定波长408nm、反应温度是35℃、pH为6.0、酶液用量0.15mL,最适底物为邻苯二酚,底物浓度为0.056mol·L~(-1);(2)POD最佳反应体系:测定波长410nm,反应温度为40℃,最佳pH为5.5,酶液用量0.1mL,底物是愈创木酚,浓度为0.067mol·L~(-1)。     

正交法优选乌蔹莓过氧化物酶活性的测定条件

[目的]优选乌蔹莓过氧化物酶活性的测定条件.[方法]以酶活力为考察指标,通过正交试验,研究酶体积、底物体积、反应体系的酸碱度和反应温度等不同条件对乌蔹莓过氧化物酶活性的影响.[结果]影响乌蔹莓过氧化物酶活性测定的因素大小顺序依次是：底物体积＞温度＞酶体积＞ pH.乌蔹莓过氧化物酶活性测定的最佳条件为：0.5 ml浓度2％的H2O2,温度为35℃,酶体积为0.1ml,pH值为5.5.[结论]底物体积和温度是影响过氧化物酶活性的主要因素.     

鲮鱼蛋白酶解条件的研究

采用木瓜蛋白酶水解鲮鱼鱼蛋白,对酶解的工艺条件进行优化研究,分析酶浓度、底物浓度、温度、pH值、反应时间等因素对鲮鱼蛋白水解的影响。试验结果表明,木瓜蛋白酶水解鲮鱼蛋白的最佳条件为:酶浓度1.5%,底物浓度2.5%,酶解温度60℃,pH值6.0,反应时间3 h,在此条件下木瓜蛋白酶酶解鲮鱼蛋白所得酶解液中游离氨基态氮含量为585.20 mg/L。     

鲫鱼肌肉AChE的提取、纯化及活性研究

以鲫鱼肌肉为原料提取乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE),然后采用改进的Ellman方法按照正交试验设计分别测定不同环境条件(pH值,温度,时间)下粗酶液活性,得到测定AChE活性的最佳条件组合.再将粗酶液依次通过DEAE-Sephadex A-50和Sephadex G-200柱层析纯化.结果表明,3个因素对AChE活性影响的顺序为温度＞pH值＞时间;最佳酶活性测定条件组合为环境温度35℃,体系pH值8.0,反应时间30 min;经Sephadex A-50柱层析后的纯化倍数是17.73,产率为40.06%;经Sephadex G-200柱层析后的纯化倍数是47.29,产率为20.65%.     

尖孢镰刀菌中β-D-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究

试验以对硝基-β-D-葡萄糖苷为底物,对尖孢镰刀菌中的β-D-葡萄糖苷酶活性测定条件进行了研究,包括缓冲液pH值、底物浓度、反应温度和时间等条件对酶活性的影响。结果表明,当温度为50℃、pH5.0、底物浓度达到4 mmol/L、反应时间为16 m in时,酶活力达到最大。     

荞麦蛋白的酶水解工艺条件研究

为确定木瓜蛋白酶水解荞麦蛋白的最佳工艺条件,以水解度(DH)为指标,系统分析了pH、温度、酶用量、时间、底物浓度等5个因素对木瓜蛋白酶水解荞麦蛋白的影响,并在此基础上进行了二次回归正交旋转试验(4因素全面试验),建立了木瓜蛋白酶水解荞麦蛋白的数学模型。结果表明,木瓜蛋白酶在底物浓度80 g/L、温度45℃、酶用量20 000 U/g、pH值7.0、反应时间为3 h时,荞麦蛋白的水解度可达14.38%。各因素对荞麦蛋白水解的影响顺序依次为:温度>pH值>酶用量>底物浓度。     

固定化菊粉酶酶解菊芋提取液制备果糖的研究

[目的]研究固定化菊粉酶酶解菊芋提取液制备果糖的适宜反应条件。[方法]以菊芋提取液为原料,以固定化菊粉酶酶法制备果糖,采用蒽酮比色法测定总糖含量,采用3,5-二硝基水杨酸法测定果糖含量,研究了底物浓度、反应温度、pH值、加酶量对果糖制备的影响。[结果]底物浓度、反应温度、pH值、加酶量对果糖制备均有显著影响。固定化菊粉酶酶解菊芋提取液制备果糖的适宜反应条件为:底物浓度10%(W/V),反应温度60℃,pH值5.0,加酶量3.0U/g菊糖。在适宜条件下反应12h,底物降解率为98.2%,果糖占总糖的87.6%,总转化率高。[结论]固定化菊粉酶既保持了游离酶的活性,又具有固定酶的功效,具有实用价值。     

不同温度和密度下黑肩绿盲蝽对褐飞虱的功能反应

在实验室条件下,开展不同温度和密度下黑肩绿盲蝽对褐飞虱的功能反应试验,用该方法定量评价黑肩绿盲蝽对褐飞虱的捕食作用。结果表明,黑肩绿盲蝽对褐飞虱若虫的功能反应为HollingⅡ型反应,在温度为24-35℃时,24-30℃黑肩绿盲蝽的捕食量随温度的升高而增加,在30℃时捕食量达到最大值,30-35℃捕食量随温度的升高而降低。在不同密度下,黑肩绿盲蝽的捕食量随密度的增大而增加,捕食量在一定范围内随着猎物密度的增加而增加,若虫的捕食能力大于成虫;4龄若虫理论捕食量最大,为104.2粒卵/d。数值反应研究结果表明,不同褐飞虱卵密度对黑肩绿盲蝽的生长、发育、繁殖有着显著影响。随着猎物密度增大,黑肩绿盲蝽若虫发育迅速、雌虫产卵量、孵化率及雌性比增大,成虫寿命减小,最后趋于稳定。     

Alcalase酶水解玉米蛋白粉制备可溶性肽最佳条件的研究

对影响Alcalase酶水解玉米蛋白粉水解度的主要因素为底物浓度、酶浓度、温度和pH值进行了研究。通过对正交试验数据的分析,结果表明,对水解度影响最大的因素为酶浓度,其次是底物浓度和温度,pH值影响最小。最佳水解条件为:酶浓度2.5%、底物浓度5%、温度50℃和pH值8.5,在此条件下,水解6h,水解度可达28.53%。以后随着时间的延长,水解度基本上没有变化。     

植酸酶催化活性的研究

[目的]控制影响酶促反应的因素,确定酶促反应的最佳条件,提高收率。[方法]在温度、pH值、底物浓度、反应时间等不同条件下利用植酸酶催化植酸水解,判断不同因素对水解结果影响的大小,筛选出植酸酶催化植酸水解生成肌醇的较好工艺条件。[结果]水解植酸的最佳工艺条件是：温度为37℃、pH值为5.0、底物浓度为10%、反应时间为16h。[结论]在最佳工艺条件下可以较好地生产肌醇。     

玉米中β-D-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究

为了研究玉米植株中β-D-葡萄糖苷酶测定的最佳条件,建立快速准确的β-D-葡萄糖苷酶活性的检测方法。本试验以玉米品种泰玉11号为研究材料,研究了以对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物,分光光度比色法测定玉米叶中β-D-葡萄糖苷酶活性的反应条件(包括缓冲液pH值、底物浓度、测定波长、反应温度和时间)。结果表明,当反应温度为40℃、反应时间为40 min、缓冲液pH值4.8、反应底物pNPG的浓度为10 mmol·L~(-1)、测定波长为402 nm时,β-D-葡萄糖苷酶的活力最大。     

纤维素酶对小麦秸秆降解的响应面分析

为了提高纤维素酶对小麦秸秆的降解效率,以还原糖的生成量为依据,通过在研究影响纤维素酶的动力学单因素基础上,应用响应面优化选择最适的降解条件。结果表明:影响小麦秸秆降解的因素依次为:酶浓度底物浓度p H反应时间反应温度。通过响应面优化得到最适降解条件为:酶浓度20.00 g/L、底物浓度0.60 g/L、p H4.8、酶反应时间12 h、酶反应温度50℃。     

星豹蛛乙酰胆碱酯酶（AChE）活性测定及药剂对其活性的抑制作用

[目的]系统研究星豹蛛（Pardosa astrigera）乙酰胆碱酯酶（AChE）的性质,确定其抗药性的发生和发展及其抗性水平,建立快速、准确的AChE活性检测方法。[方法]采用正交试验设计确定星豹蛛不同部位AChE活性测定的最优条件组合,并在此基础上进一步研究豹蛛AChE的体躯分布及其对4种常用药剂的敏感度。[结果]星豹蛛头胸部、腹部和附肢AChE活性测定的最优条件组合是：酶浓度分别为12、18、29 g/L;底物浓度分别为0.6、1.0、1.0 mmol/L;反应体系pH值均为7.0;反应温度分别为30、35、35℃;反应时间均为5min。AChE主要分布在星豹蛛的头胸部,提取液中含有Triton X-100时,AChE的比活力要比无Triton X-100时大。灭多威、辛硫磷、高效氯氰菊酯、毒死蜱对星豹蛛头胸部中AChE的抑制中浓度（IC50）分别为7.76×10-5、1.76×10-4、4.12×10-4、4.94×10-4mol/L。[结论]星豹蛛体内AChE是膜结合的;4种药剂对星豹蛛头胸部中AChE的抑制具有很好的剂量效应,表明星豹蛛头胸部AChE可以作为环境中有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类农药污染的生物化学标记。