鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。     

绵羊γ干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及产物的抗病毒活性

干扰素(IFN)具有广谱的抗病毒作用,利用杆状病毒表达系统安全、高效和后加工过程完整的特点,在家蚕体内表达生产重组绵羊γ干扰素(Ovi IFN-γ)。依据家蚕的密码子偏好性对Ovi IFN-γ基因核苷酸序列进行优化和PCR,并克隆了带有His标签编码序列的Ovi IFN-γ基因序列Ovi IFN-His-Tagged-γ,构建分别插入Ovi IFN-γ和Ovi IFN-His-Tagged-γ基因的重组病毒。将2种重组病毒感染家蚕5龄幼虫,Western blot检测蚕体血淋巴中重组Ovi IFN-γ和Ovi IFN-His-Tagged-γ成功表达。采用细胞病变抑制法测定蚕体血淋巴中重组Ovi IFN-γ的效价为1.6×106U/m L,重组Ovi IFN-His-Tagged-γ的效价为2.8×105U/m L,前者的抗病毒活性强于后者,稀释至2.0×104倍时,能够完全抑制VSV-GFP病毒感染。上述结果为利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内高效、安全生产具有抗病毒活性的重组绵羊γ干扰素提供了试验依据。     

重组牛IFN-γ蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化和鉴定

为合成与天然构象相似的干扰素γ蛋白,通过优化干扰素序列的密码子序列,利用杆状病毒表达系统合成真核重组牛IFN-γ蛋白.实验化学合成牛IFN-γ基因,并将该基因克隆至真核表达载体pFastBacHTA中,将构建成功的重组载体与DH10Bac感受态大肠杆菌进行转座形成穿梭载体,穿梭载体质粒瞬时转染至SF9昆虫细胞中,获得重...     

杆状病毒表达系统中NLS序列对鸭圆环病毒Cap基因表达的影响及其免疫原性研究

为了研究核定位信号肽(Nuclear localization signal, NLS)序列对鸭圆环病毒(duck Circovirus, DuCV)Cap蛋白表达的影响,并探究不同免疫策略下重组蛋白的免疫原性,试验将去除和未去除NLS序列的DuCV Cap基因分别克隆至杆状病毒载体pFastBacⅠ中,通过杆状病毒表达系统进行表达,分析NLS序列对Cap蛋白表达的影响。采用不同的免疫策略,分别以原核表达系统构建的重组蛋白rCap(rCap组)、杆状病毒表达系统构建的rvAc-Cap(rvAc-Cap组)及rCap与rvAc-Cap联合(Prime-Boost组)作为免疫源免疫Balb/c小鼠,并设置PBS对照组,定期采血,检测DuCV IgG抗体水平、淋巴细胞增殖指数(SI)和γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)等细胞因子水平,评价其免疫效果。结果表明：利用杆状病毒表达系统成功表达出重组杆状病毒rvAc-Cap和rvAc-NLS-Cap,且去除NLS序列的Cap基因表达水平更高;小鼠免疫重组蛋白rCap后,重组蛋白rCap与重组杆状病毒rvA...     

利用家蚕杆状病毒表达系统表达人γ干扰素及产物的抗病毒活性检测

干扰素-γ(IFN-γ)是免疫反应中重要的免疫调节因子,对多种免疫细胞具有激活作用.利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达具有活性的人γ干扰素(hIFN-γ),首先根据家蚕密码子偏好性对hIFN-γ的编码基因进行优化合成,将优化合成后的序列克隆到杆状病毒转移载体pBR中,然后与orf1629基因缺失的失活拯救型杆状病毒BmBacmid共转染BmN细胞,获得重组病毒reBmBac-hIFN-γ,最后利用获得的重组病毒感染家蚕并收获表达产物.采用微量细胞病变抑制法,在Vero/VSV-GFP系统中检测到重组hIFN-γ 的效价达到(3.69±2.02)×106 IU/mL.此外,重组hIFN-γ可以抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖.上述结果为利用家蚕生物反应器高效生产具有活性的人γ干扰素奠定了试验基础.     

鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

本研究构建了表达鸡-γ-干扰素（Chicken interferon-γ，ChIFN-γ）的重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ。采用鼠抗ChIFN-γ免疫血清作为一抗进行间接免疫荧光（1FA）及间接ELISA检测，表明ChIFN-γ在重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ感染的昆虫细胞中获得表达。细胞病变抑制法测定重组ChIFN-γ抗病毒活性试验显示，重组杆状病毒表达ChIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的复制。而且其抗病毒活性可以被鼠抗ChIFN-γ免疫血清阻断。试验结果表明，重组杆状病毒能良好表达ChIFN-γ，并具有高效抗病毒活性。     

重组杆状病毒表达鸭圆环病毒Cap蛋白及活性检测

为了获得具有活性的鸭圆环病毒Cap蛋白,笔者通过PCR方法获得鸭圆环病毒I型完整Cap基因片段,将其克隆到昆虫杆状病毒基因组中,获得重组杆状病毒qBac-P-Cap,其病毒效价TCID_(50)可以达到9.25。重组杆状病毒可在悬浮Sf9细胞中表达具有活性的鸭圆环病毒Cap蛋白。研究表明蛋白表达最佳收获时间为120 h,纯化后蛋白表达量可以达到200μg/mL。这为进一步研究Cap蛋白功能和大规模制备鸭圆环疫苗奠定了基础。     

悬浮培养Sf21细胞高效表达牛γ-干扰素及其特性鉴定

本试验旨在研究重组牛γ-干扰素(rBovIFN-γ)在Sf21细胞中高效表达及其特性鉴定。利用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从奶牛外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出不含信号肽的BovIFN-γ基因片段。将其克隆到pFastBac^TMHTA中构建重组质粒pFastBac^TMHTA-BovIFN-γ。然后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid-BovIFN-γ。转染Sf21昆虫细胞后获得重组杆状病毒rBac-BovIFN-γ,应用Sf21细胞悬浮培养技术大量表达rBovIFN-γ。利用Western blotting、质谱分析(MS)、抗病毒试验等对rBovIFN-γ进行鉴定。Western blotting分析显示,rBovIFN-γ具有良好的反应原性;MS分析表明,rBovIFN-γ的6个肽段序列与牛IFN-γ的氨基酸序列完全匹配,在蛋白质质谱数据库中搜索结果为牛IFN-γ;MDBK/VSV抗病毒试验显示,rBovIFN-γ具有很高的抗病毒活性,为1.05×10⁵ IU/mg。     

鸭坦布苏病毒E基因重组杆状病毒的构建与间接ELISA检测方法的建立

研究旨在建立基于真核表达的鸭坦布苏病毒(DTV)E蛋白的诊断鸭坦布苏病毒病的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,构建含有DTV E基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出55 ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid DTV E蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。利用该方法对135份来自江苏省的樱桃谷鸭血清样品进行检测,发现其血清阳性率达79.3%。表明建立的间接ELISA检测方法特异性强、重复性好、敏感性高,可以用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断。     

蜂素信号肽介导猪干扰素-γ在杆状病毒中分泌表达及抗病毒活性检测

应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟的猪干扰素-γ基因插入供体质粒pFastBacTM1polyhedrin启动子控制下的多克隆位点,引入昆虫细胞可识别的蜂素信号肽(Honeybee melittin signal peptide)取代猪干扰素-γ原有信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体质粒,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组蛋白通过SDS-PAGE、间接免疫荧光、Western-blot证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性是1.38×106U/mL。     

鸭坦布苏病毒E基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性与保护性研究

鸭坦布苏病毒(DTMUV)为新出现的病毒,主要引起鸭产蛋量急剧下降。本研究通过杆状病毒表达系统,利用蜂素信号肽(honeybee melittin signal peptide,Mels)构建分泌表达DTMUV JSXZ株E蛋白的重组杆状病毒,将其感染Sf9昆虫细胞,从而分泌表达DTMUV E蛋白,并对该表达E蛋白的免疫原性和保护效果进行了研究。经Western blotting、IFA试验证明E蛋白可以在Sf9昆虫细胞培养上清中分泌表达;通过免疫雏鸭试验、间接ELISA结果证明E蛋白可以诱导产生高水平的IgG血清抗体;MTT试验结果显示E蛋白能刺激T 淋巴细胞增殖;攻毒保护试验结果显示0.3 mL组免疫保护率为80%,0.6 mL组和0.8 mL组保护率均为100%,而PBS对照组雏鸭均表现为典型的DTMUV感染症状,其中3只死亡。上述研究结果为DTMUV亚单位疫苗的研究奠定基础。     

猪α+γ共表达干扰素在不同家蚕品种中的表达

本实验拟探索猪α+γ复合型干扰素(IFN-α+γ)共表达重组杆状病毒r Bm NPV(Bm-α+γ)在不同家蚕品种中的表达效率,以期筛选出较适合共表达猪IFN-α+γ的家蚕品种。实验分别对24个原种和7对杂交种共38个家蚕品种的蚕蛹接种重组杆状病毒r Bm NPV(Bm-α+γ),然后利用ELISA方法对猪IFN-α进行表达量检测和比较。结果显示不同家蚕品种对猪α干扰素的表达不同,日系原种的表达量要高于中系原种,且日系×中系杂交种组合普遍高于中系×日系杂交组合。     

鹅α和γ干扰素基因的克隆及序列分析

从植物血凝素(PHA)刺激的鹅外周血白细胞提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增鹅IFN基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列分析.克隆到的鹅IFN-α和IFN-γ基因与GeneBank上已公布的鸭IFN核苷酸序列进行比较,其同源性分别为IFN-α96.70%、IFN-γ94.95%;氨基酸序列同源性分别为IFN-α93.72%、IFN-γ93.29%.这为进一步研究鹅干扰素的生物学特性和应用奠定了基础.     

表达鸡γ-干扰素重组鸡传染性支气管炎病毒的构建及鉴定

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究以IBV疫苗株H120为病毒载体,在其非结构蛋白5a编码区上游插入鸡γ-干扰素(Ch IFN-γ)基因,通过反向遗传操作技术构建重组病毒。经RT-PCR和测序鉴定表明拯救获得重组病毒(r H120-c IFNγ/5a)。生物学特性研究结果表明,r H120-c IFNγ/5a感染鸡胚后能够引起特征性病变,但与其亲本病毒株H120相比,病毒的毒价及其在鸡胚中的复制能力有所下降。将r H120-c IFNγ/5a在鸡胚中连续传代,采用RT-PCR进行检测,结果表明Ch IFN-γ基因在病毒传至第9代时仍保持稳定,至第12代Ch IFN-γ基因出现部分或完全丢失现象。本研究结果为进一步研制以IBV为载体的新型基因重组疫苗奠定了基础。     

吉林白鹅α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。     

牛-干扰素在昆虫细胞中的高效表达

应用RT-PCR技术从经植物血凝素(PHA)刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛-γ干扰素基因(bovine interferon-γ,BovIFN-γ)cDNA,并克隆到pGEM-T easy载体中,经过限制性酶切分析和测序证实,所克隆到的基因编码区序列与已报道的序列完全一致。将含信号肽的BoIFN-γ基因整个编码区cDNA亚克隆到杆状病毒转座载体pFastBac中,构建了转移载体pFastBac-BoIFN-γ,转座到宿主菌DH10Bac中,在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG和X-gal的KGTIX LB平板上筛选白色菌落,提取DNA获得重组穿梭载体Bacmid-BoIFN-γ质粒,与脂质体共转染Sf9细胞,产生有感染力的重组杆状病毒reBac-BoIFN-γ。重组病毒经过传代扩增感染Sf9细胞,通过IFA试验、Western-blot和抗病毒活性测定证实,BoIFN-γ基因在感染的昆虫细胞和上清中得到了表达,上清中活性可达2.651×105U/mL。表达条件优化结果表明,不同MOI对rBoIFN-γ的表达产量影响不大,上清中干扰素活性在感染后5d达到高峰。     

杆状病毒表面展示鸭坦布苏病毒E蛋白的免疫原性及保护效果的研究

鸭坦布苏病毒(DTMUV)为新出现的病毒,主要引起鸭的产蛋量急剧下降.为评价真核表达DTMUV的E蛋白的免疫原性,本研究利用杆状病毒表面展示技术,构建表面展示DTMUV JSXZ株E蛋白的重组杆状病毒(rBV-DTMUV-E),将其感染昆虫细胞,从而将E蛋白展示在杆状病毒的表面,并对表达的重组E蛋白(rE)的免疫原性和保护效果进行研究.经western blot和间接免疫荧光试验证明rE能够在Sf9细胞中有效表达;并且呈可溶性表达.重组蛋白经镍柱纯化,并采用氢氧化铝乳化(0.1 μg/mL),分别以0.2 mL、0.4 mL和0.6 mL的剂量免疫雏鸭,通过ELISA抗体检测结果证明,rE可以诱导产生高水平的IgG血清抗体;MTT试验结果表明,rE能够刺激T淋巴细胞增殖;攻毒保护试验结果显示,其0.2 mL组免疫保护率为80％,0.4 mL和0.6 mL组保护率均为100％,而对照组雏鸭均表现为典型的DTMUV感染症状,其中4只死亡.以上研究结果为DTMUV亚单位疫苗的研究奠定了基础.     

1型鸭肝炎病毒E53株VP1基因在昆虫细胞中的表达及产物分析

根据1型鸭肝炎病毒E53株基因组序列设计并合成一对特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因,将其定向克隆至pFastBacTMHTB载体,转化至DH10BacTM感受态细胞中,蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒rBacmid-VP1,重组质粒在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。结果表明VP1蛋白在昆虫细胞中获得表达,表达产物能够与兔抗1型鸭肝炎病毒VP1蛋白多抗血清和鸭肝炎病毒阳性血清发生特异性反应。在昆虫细胞中表达VP1蛋白为VP1功能的研究及鸭肝炎病毒抗体的检测提供了物质材料。     

牛γ-干扰素在昆虫细胞中的高效表达

应用RT-PCR技术从经植物血凝素(PHA)刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛-γ干扰素基因(bovine interferon-γ,BovIFN-γ)cDNA,并克隆到pGEM-T easy载体中,经过限制性酶切分析和测序证实,所克隆到的基因编码区序列与已报道的序列完全一致.将含信号肽的BoIFN-γ基因整个编码区cDNA亚克隆到杆状病毒转座载体pFastBac Ⅰ中,构建了转移载体pFastBac 1-BoIFN-γ,转座到宿主菌DH10 Bac中,在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG和X-gal的KGTIX LB平板上筛选白色菌落,提取DNA获得重组穿梭载体Bacmid-BoIFN-γ质粒,与脂质体共转染Sf9细胞,产生有感染力的重组杆状病毒reBac-BoIFN-γ.重组病毒经过传代扩增感染Sf9细胞,通过IFA试验、Western-blot和抗病毒活性测定证实,BoIFN-γ基因在感染的昆虫细胞和上清中得到了表达,上清中活性可达2.651×105U/mL.表达条件优化结果表明,不同MOI对rBoIFN-γ的表达产量影响不大,上清中干扰素活性在感染后5 d达到高峰.     

猫ω型干扰素在家蚕杆状病毒表达系统的表达及活性检测

将优化合成的猫ω型干扰素基因Fe IFN-ω2和Fe IFN-ω9克隆到杆状病毒转移载体p VL1393的多角体蛋白基因启动子下游,与orf1629基因缺损的家蚕杆状病毒Bm-Bacmid DNA共转染Bm N细胞进行同源重组,将获得的重组病毒感染家蚕5龄幼虫,利用家蚕生物反应器表达猫ω型干扰素。采用微量细胞病变抑制法在CRFK细胞/VSV*GFP系统上检测家蚕幼虫血淋巴中表达的重组猫ω型干扰素具有抗病毒活性,其中表达产物重组Fe IFN-ω2的抗病毒活性可达6.3×105U/m L,而重组Fe IFN-ω9的抗病毒活性较低。研究结果为利用家蚕生物反应器生产重组猫ω型干扰素生物制剂奠定了一定的试验基础。