山羊HSPA6蛋白的特性分析及互作蛋白网络构建

为了研究山羊热休克蛋白70(HSP70)家族成员HSPA6基因编码蛋白的结构与功能特性,本研究利用生物信息学方法,分析了山羊HSPA6基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化修饰位点、亚细胞定位,以及蛋白的二级结构和三级结构;选取多种生物的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树,另外还对HSPA6进行了蛋白互作网络分析。结果显示,山羊HSPA6蛋白序列与哺乳动物(牛、猪)的序列同源性较高;山羊HSPA6蛋白分子质量为70.9 ku,理论等电点为5.78,属于酸性蛋白和亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽;蛋白质功能预测结果显示,HSPA6包含10个分值很高的可能磷酸化位点,这些位点分布在N-端的核苷酸结合结构域(NBD)和C-端的多肽结合结构域(PBD)。经序列分析发现,HSPA6 C-端含有EEVD基序,是HSP70家族蛋白定位于细胞质的保守基序,表明HSPA6主要分布在细胞质。蛋白质二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,分别占41.52%和33.75%,为混合型蛋白;蛋白互作网络构建结果显示,和HSPA6相互作用的蛋白包括HSP70家族成员,另外也有HSP40、HSP90家族成员,预示着山羊HSPA6可能在细胞内与HSP40和HSP90形成复合体发挥作用。本试验结果为进一步深入探讨山羊HSPA6响应环境应激的功能机制提供了理论依据。     

河流型水牛热休克蛋白70的原核表达及其对精液抗冻性的影响

试验旨在克隆河流型水牛热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因的CDS区序列,构建HSP70原核表达载体,诱导表达HSP70融合蛋白,进一步研究HSP70蛋白对水牛精液抗冻性的影响。以摩拉水牛精子基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增HSP70基因CDS区序列,将PCR产物与pET30a质粒连接构建重组原核表达质粒,诱导表达HSP70融合蛋白,将获得的表达蛋白作为稀释液组分添加到水牛精液中制作冷冻精液并评定其活力。结果显示,试验成功扩增获得HSP70基因CDS区长为2 155 bp的片段;SDS-PAGE及Western blotting分析显示,在70 ku处出现一条明显条带,且表达产物可与相应的抗体发生反应;对添加有HSP70蛋白的水牛冷冻精液活力评定结果显示,终浓度为2、4、8 mg/mL的HSP70能提高冷冻精液活力,且8 mg/mL HSP70组冻精活力最高,但各组间差异均不显著（P>0.05）。综上所述,本试验成功表达了水牛HSP70蛋白,获得了高纯度、有活性的HSP70融合蛋白,外源添加HSP70蛋白可提高水牛冷冻精液的活力,为进一步研究水牛HSP70蛋白的抗冻性保护机理奠定了理论基础。     

河流型水牛热休克蛋白70的原核表达及其对精液抗冻性的影响

试验旨在克隆河流型水牛热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)基因的CDS区序列,构建HSP70原核表达载体,诱导表达HSP70融合蛋白,进一步研究HSP70蛋白对水牛精液抗冻性的影响。以摩拉水牛精子基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增HSP70基因CDS区序列,将PCR产物与pET30a质粒连接构建重组原核表达质粒,诱导表达HSP70融合蛋白,将获得的表达蛋白作为稀释液组分添加到水牛精液中制作冷冻精液并评定其活力。结果显示,试验成功扩增获得HSP70基因CDS区长为2 155bp的片段;SDS-PAGE及Western blotting分析显示,在70ku处出现一条明显条带,且表达产物可与相应的抗体发生反应;对添加有HSP70蛋白的水牛冷冻精液活力评定结果显示,终浓度为2、4、8mg/mL的HSP70能提高冷冻精液活力,且8mg/mL HSP70组冻精活力最高,但各组间差异均不显著(P0.05)。综上所述,本试验成功表达了水牛HSP70蛋白,获得了高纯度、有活性的HSP70融合蛋白,外源添加HSP70蛋白可提高水牛冷冻精液的活力,为进一步研究水牛HSP70蛋白的抗冻性保护机理奠定了理论基础。     

河流型水牛热休克蛋白70(HSP70)基因CDS序列的多态性分析

为了研究河流型水牛HSP70基因CDS序列的多态性,试验首先从摩拉水牛、尼里/拉菲水牛、槟榔江水牛、地中海水牛冷冻精液中抽提基因组DNA,以基因组DNA为模板扩增获得河流型水牛HSP70基因,对其进行基因克隆,测序,序列分析;其次对26头摩拉水牛、43头尼里/拉菲水牛HSP70基因CDS序列进行测序、高分辨率熔解曲线检测分析。结果显示:河流型水牛的HSP70基因CDS序列长度为1927bp,4个品种HSP70基因CDS序列相似度高达99%以上;摩拉、尼里/拉菲种公牛HSP70基因CDS序列存在相同的SNP位点,分别是C602T、A708T、A1284G,并产生不同的基因型。摩拉公牛HSP70基因CDs区602bp位点、尼里/拉菲602bp位点处于Hardy-Weinberg不平衡状态。试验结果说明了HSP70基因在进化上具有高度保守性,但在同一群体中存在多态性。     

山羊HSPA6蛋白的特性分析及互作蛋白网络构建

为了研究山羊热休克蛋白70（HSP70）家族成员HSPA6基因编码蛋白的结构与功能特性,本研究利用生物信息学方法,分析了山羊HSPA6基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化修饰位点、亚细胞定位,以及蛋白的二级结构和三级结构;选取多种生物的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树,另外还对HSPA6进行了蛋白互作网络分析。结果显示,山羊HSPA6蛋白序列与哺乳动物（牛、猪）的序列同源性较高;山羊HSPA6蛋白分子质量为70.9 ku,理论等电点为5.78,属于酸性蛋白和亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽;蛋白质功能预测结果显示,HSPA6包含10个分值很高的可能磷酸化位点,这些位点分布在N-端的核苷酸结合结构域（NBD）和C-端的多肽结合结构域（PBD）。经序列分析发现,HSPA6 C-端含有EEVD基序,是HSP70家族蛋白定位于细胞质的保守基序,表明HSPA6主要分布在细胞质。蛋白质二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,分别占41.52%和33.75%,为混合型蛋白;蛋白互作网络构建结果显示,和HSPA6相互作用的蛋白包括HSP70家族成员,另外也有HSP40、HSP90家族成员,预示着山羊HSPA6可能在细胞内与HSP40和HSP90形成复合体发挥作用。本试验结果为进一步深入探讨山羊HSPA6响应环境应激的功能机制提供了理论依据。     

水牛黑色素皮质素1受体基因克隆、生物信息学分析及表达模式研究

本试验旨在对水牛黑色素皮质素1受体(MC1R)基因进行克隆、生物信息学分析及表达模式研究。参考牛MC1R基因(GenBank登录号:JN123363.1)序列设计引物,以本地沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增克隆MC1R基因片段并进行测序分析。运用QRT-PCR方法检测摩拉水牛、沼泽水牛、白沼泽水牛和黄牛皮肤组织中MC1R基因的表达模式,并通过Western blotting方法检测沼泽水牛和白沼泽水牛MC1R基因的蛋白表达差异。结果表明,应用PCR方法成功克隆了水牛MC1R基因,其编码区全长954 bp,共编码317个氨基酸。测序分析后发现沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛MC1R基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似性很高。沼泽水牛与白沼泽水牛在476、618、881、930和931 bp位点上分别发生T→C、G→C、G→A、G→A和A→G突变,导致了沼泽水牛和白沼泽水牛第159位氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸,第310位氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸,第294位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸,发生了非同义突变。QRT-PCR结果发现,MC1R基因在摩拉水牛、沼泽水牛和黄牛皮肤组织中的相对表达量均显著高于白沼泽水牛(P<0.05);Western blotting分析结果显示,沼泽水牛皮肤组织中MC1R蛋白的表达量高于白沼泽水牛。综上所述,白沼泽水牛MC1R基因的编码区发生氨基酸位点突变,且相对表达量和蛋白表达量均低于沼泽水牛,推测此为白沼泽水牛体内合成的黑色素缺失而导致毛色白化的主因。     

河流型与沼泽型水牛FSHR基因密码子偏好性分析

为了确定河流型与沼泽型水牛促卵泡素受体(FSHR)基因密码子的使用模式,试验采用PCR产物直接测序法对9头河流型水牛、15头沼泽型水牛、6头大额牛和6头中甸牦牛的FSHR基因编码区序列进行了群体变异检测和单倍型划分,并结合已发表的普通牛、野牛、山羊、绵羊、人和黑猩猩的同源序列,对河流型与沼泽型水牛FSHR基因密码子使用的偏好性及与其他物种的差异进行了探讨。结果表明:两类水牛FSHR基因的密码子使用特征较为相似,河流型与沼泽型水牛分别有28个和27个偏好使用的密码子,对于编码Pro的4个密码子CCC、CCA、CCU和CCG而言,河流型水牛偏好使用CCC和CCA,而沼泽型水牛偏好使用CCC。水牛与其他物种共同偏好使用的密码子有20种,均偏好使用以G/C结尾的密码子。基于密码子的同义密码子相对使用度(RSCU)构建的聚类树显示河流型水牛与沼泽型水牛先聚为一类,再与大额牛、牦牛聚为一类,普通牛与山羊、绵羊和野牛聚为一类,人和黑猩猩聚为一类,揭示聚为一类的物种间在密码子使用上的偏好性较相似。     

水牛MYF5基因克隆分析及真核表达载体构建

本研究旨在对广西沼泽型水牛MYF5基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体。应用RT-PCR方法从水牛肌肉组织中扩增MYF5基因,测序鉴定后对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体,并在细胞水平验证所构建载体的正确性。结果表明:水牛MYF5基因编码区序列长度为768 bp,编码255个氨基酸,其核苷酸序列与牛、山羊、猪、人、猩猩和狼相应序列的相似性分别为99%、98%、94%、91%、90%和89%;水牛MYF5基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;MYF5蛋白为膜外蛋白,具有MYOD家族标志性MYOD结构域;构建水牛MYF5基因真核表达载体pMXs-MYF5,转染HEK293T、水牛颗粒细胞后产生绿色荧光信号,表明细胞表达MYF5基因。     

利用微卫星DNA标记分析槟榔江水牛群体遗传特征

槟榔江水牛是近年在我国云南西部发现的第一个本土河流型水牛.为了揭示其群体遗传多样性、群体遗传组成、其与河流型和沼泽型水牛的遗传关系及沼泽型水牛对该水牛的基因渗入等重要遗传背景信息,本研究采用30个微卫星DNA标记对141份槟榔江水牛样品和对照群体24份河流型水牛(摩拉水牛)样品、41份沼泽型水牛(滇东南水牛)样品进行了检测分析.结果,在槟榔江水牛群体中共检测到253个等位基因,其中,54个为3个群体所共享的等位基因,58个为只在槟榔江水牛与摩拉水牛间共享的等位基因,73个为只在槟榔江水牛与滇东南水牛间共享的等位基因,其余68个等位基因为该群体所独有.槟榔江水牛平均等位基因数、平均表观杂合度、平均期望杂合度和多态信息含量等参数均显著高于对照组群体,分别为8.433 3、0.640 5、0.600 9和0.594 7.该水牛群体近交系数FIS值为0.061 9.槟榔江水牛与摩拉水牛间的DA遗传距离为最小(0.114 4),在NJ树上聚为一支;而滇东南水牛与槟榔江水牛和摩拉水牛间的遗传距离较大(分别为0.382 9和0.555 3),其在NJ树上单独聚为一支.群体遗传结构分析显示,槟榔江水牛遗传组分为河流型与沼泽型2种类型水牛混合的模式(当K=2时),整个群体中有相当数量的个体存在沼泽型水牛的遗传渗入(群体中沼泽型水牛遗传组分为0.067 2).结果揭示,槟榔江水牛遗传资源独特,群体遗传多样性丰富,但该群体杂合子缺乏,且存在一定沼泽型水牛的基因渗入.     

水牛白细胞介素-2基因的克隆及其序列分析

根据GeneBank上发表的牛IL-2基因序列,设计一对引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激培养9h、17h的沼泽型水牛外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出水牛IL-2基因.琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为724bp,分离纯化,克隆到pMD18-T载体.经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,以及核苷酸测序结果显示,克隆的水牛IL-2基因与GeneBank上发表的序列同源性为99.8%.     

水牛瘦素受体基因密码子使用偏好性分析

试验选取27头河流型水牛和41头沼泽型水牛,以从NCBI数据库中下载的家牛、野牦牛、野牛、绵羊、山羊、小鼠和人的序列作对照,对编码瘦素受体（leptin receptor,LEPR）基因的密码子偏好性及水牛与其他物种间密码子使用的差异和进化关系进行了深入分析。结果发现,所有的密码子在河流型水牛和沼泽型水牛LEPR基因中均有使用,两种类型水牛偏好使用的密码子有28个,其中使用偏好性较强的密码子为AGA（RSCU≥2）,表明河流型水牛和沼泽型水牛LEPR基因密码子使用特征相似。水牛及参考物种LEPR基因均偏好使用以A/U结尾的密码子,但水牛与其他参考物种间偏好使用密码子的种类和数目有差异。密码子使用偏好聚类分析表明,河流型水牛与沼泽型水牛亲缘关系最近,先聚为一类,然后与家牛、野牦牛和野牛聚为一类,再与绵羊、山羊、小鼠和人等物种聚为一类。在密码子使用频率上,河流型水牛LEPR基因与酵母密码子偏好性差异小于与大肠杆菌和小鼠密码子偏好性差异,从而揭示酵母更适合作为水牛LEPR基因的外源表达系统。     

沼泽型水牛微卫星DNA的遗传多样性分析

为探究中国沼泽型水牛品种或类群的遗传多样性,本研究采用了沼泽型水牛30个微卫星标记结合LabChip芯片检测法对德昌水牛、德宏水牛、温州水牛、贵州水牛、西林水牛、富钟水牛及两个引进品种摩拉水牛、尼里－拉菲水牛等40个样本进行了检测和遗传多样性分析。结果表明,在30个微卫星DNA标记上共发现332个等位基因,平均基因多样性和PIC值分别为0.7808和0.7554。聚类分析结果显示,德宏水牛和德昌水牛先聚为一类,随后与富钟水牛、贵州水牛、温州水牛、西林水牛聚为一类;摩拉水牛与尼里－拉菲水牛聚为一类。本研究证实了所选的30个沼泽型水牛微卫星DNA标记可作为有效的遗传标记用于水牛品种间的遗传多样性分析,同时也丰富了当前的水牛微卫星标记资源。     

家养水牛催乳素基因外显子2多态性及其群体遗传特征

催乳素基因(prolactin gene,PRL)被视为与水牛产奶性状相关的重要候选基因,目前还未见有水牛PRL基因外显子2遗传特征的报道。本研究采用PCR-SSCP及PCR产物直接测序技术,检测了12个沼泽型水牛群体和3个河流型水牛群体共581个样本PRL基因外显子2的遗传变异。结果:水牛PRL基因外显子2由182个核苷酸组成,编码61个氨基酸,在进化上高度保守,测序结果显示沼泽型水牛群体中PRL基因外显子2有c.G192A替换,为同义替换,与泌乳性状之间没有显著相关性。在12个沼泽型水牛群体中均检测到该多态位点,PG基因频率在0.719～0.897之间,群体平均值为0.785±0.015,该基因为优势等位基因。Hardy-Weinberg平衡检测显示,10个沼泽型水牛群体处于平衡状态,而德宏水牛群体和福安水牛群体处于不平衡状态。在3个河流型水牛群体中,第192位碱基均为G,未检测到G>A替换。     

牛环形泰勒虫HSP70基因的克隆表达、特性分析及互作蛋白网络构建

为了表达牛环形泰勒虫(Theileria annulata)截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分析HSP70基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白的二级结构和三级结构;对重组蛋白HSP70进行蛋白互作网络分析;构建原核表达载体pET28a-HSP70,筛选诱导表达条件,镍柱纯化重组蛋白及检测反应原性。结果显示,牛环形泰勒虫HSP70蛋白序列与小泰勒虫的序列同源性较高,蛋白分子质量为42 ku,理论等电点(pI)为5.61,属于酸性亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽;蛋白功能预测结果显示,HSP70包含32个可能的磷酸化位点,亚细胞定位分析显示该蛋白主要分布于细胞质。蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占39.18%、8.51%、30.41%和21.91%。蛋白互作网络构建结果显示,与HSP70相互作用的蛋白主要为HSP90家族成员,另外还有伴侣蛋白GrpE同系物,预示着HSP70可能在细胞内与HSP90形成复合体发挥作用。本试验成功构建原核表达载体,获得了大小约为48 ku的融合蛋白,以0.6 mmol/L IPTG于37℃诱导5 h,蛋白表达较好;点状印迹及Western blotting结果表明,表达产物可被自然感染的牛环形泰勒虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。本试验结果为进一步探讨牛环形泰勒虫HSP70功能机制提供了理论依据。     

河流型与沼泽型水牛LEP基因同义密码子使用特征分析

为了了解影响泌乳性状的重要编码基因LEP基因的密码子使用特征,试验以27头河流型水牛和41头沼泽型水牛为研究对象,并以从NCBI数据库中下载的普通牛、野牦牛、野牛、绵羊、山羊、小鼠和人的序列作对照,对两类水牛LEP基因的同义密码子使用偏好性及水牛与其他物种间LEP基因密码子使用的差异和进化关系进行深入分析。结果表明:两种类型水牛LEP基因密码子使用特征相似,河流型和沼泽型水牛LEP基因均有25个偏好使用的密码子;其中两类水牛LEP基因偏好性较强的密码子均为UUC、CUG、AUC、GUC、UCC、ACC、GCC、CAC、CGG、AGG和GGG(RSCU≥2.00)。河流型水牛CCA和CCG密码子的RSCU值分别为0.09和0.35,而沼泽型水牛分别为0.34和0.10。此外,所有物种LEP基因均偏好使用以G/C结尾的密码子,但不同物种之间偏好使用密码子种类和数目均有差异。密码子使用偏好聚类分析表明,河流型与沼泽型水牛亲缘关系最近,聚为一类,然后依次与其他牛、绵羊、山羊、小鼠和人等物种相聚。在密码子使用频率上,LEP基因与小鼠密码子偏好性差异小于与大肠杆菌和酵母密码子偏好性的差异,说明小鼠更适合作为水牛LEP基因的外源表达系统。     

沼泽型水牛ALK3基因克隆分析与表达模式研究

试验旨在对沼泽型水牛ALK3基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在水牛组织中的表达规律进行系统研究.根据GenBank中已公布的牛ALK3基因序列设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增、克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法分析和预测了水牛ALK3的遗传进化及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用QRT-PCR技术对ALK3基因在水牛组织中的表达进行了差异分析.结果表明,水牛ALK3基因编码区全长1 599 bp,共编码532个氨基酸.多重序列比较分析显示,水牛ALK3核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、人和小鼠相应序列的同源性分别为98%、96%、95%、93%、94%和91%.系统进化树分析显示,ALK3基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性.对ALK3蛋白质的分析表明该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在丝氨酸/苏氨酸激酶和GS等结构.定量分析结果显示,ALK3在水牛生殖脊、心脏、肝脏、颗粒细胞、肺脏、卵丘细胞、肾脏、下丘脑、垂体、大脑等15种组织或细胞中有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,垂体、肺脏和睾丸次之,卵丘细胞表达量最低.本研究成功克隆了沼泽型水牛ALK3基因,并研究了其在不同水牛组织细胞中的表达规律,为阐明其在水牛繁殖过程中的功能及转基因载体构建中的应用研究奠定了理论基础.     

欧拉型藏绵羊GHRHR基因部分片段的克隆及多态性研究

对欧拉型藏绵羊生长激素释放激素受体(GHRHR)基因部分片段进行PCR扩增和克隆测序(GenBank Accession No:EU289218),利用BioEdit7.0.9.0、DnaSP 4.10.9和MEGA4.0等生物信息学软件对该部分序列与GenBank中普通牛、瘤牛、水牛相应序列进行比对分析,并对58只欧拉型藏绵羊该基因片段进行SmaI-RFLP研究。结果表明:欧拉型藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个物种基因序列间同源性大小依次为92.5%、92.0%、91.5%;4个物种间共发现41处序列间碱基差异(9.65/100 bp),其中藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个牛亚科物种均存在差异碱基29处。碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换,少数为碱基插入和缺失。推导的部分氨基酸序列间同源性大小依次为88.8%、88.8%、94.4%。58只欧拉型藏绵羊该基因片段SmaI-RFLP分析均为单态,表现为AA基因型。     

目录

为了表达牛环形泰勒虫（Theileria annulata）截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分析HSP70基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白的二级结构和三级结构;对重组蛋白HSP70进行蛋白互作网络分析;构建原核表达载体pET28a-HSP70,筛选诱导表达条件,镍柱纯化重组蛋白及检测反应原性。结果显示,牛环形泰勒虫HSP70蛋白序列与小泰勒虫的序列同源性较高,蛋白分子质量为42 ku,理论等电点（pI）为5.61,属于酸性亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽;蛋白功能预测结果显示,HSP70包含32个可能的磷酸化位点,亚细胞定位分析显示该蛋白主要分布于细胞质。蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占39.18%、8.51%、30.41%和21.91%。蛋白互作网络构建结果显示,与HSP70相互作用的蛋白主要为HSP90家族成员,另外还有伴侣蛋白GrpE同系物,预示着HSP70可能在细胞内与HSP90形成复合体发挥作用。本试验成功构建原核表达载体,获得了大小约为48 ku的融合蛋白,以0.6 mmol/L IPTG于37 ℃诱导5 h,蛋白表达较好;点状印迹及Western blotting结果表明,表达产物可被自然感染的牛环形泰勒虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。本试验结果为进一步探讨牛环形泰勒虫HSP70功能机制提供了理论依据。     

水牛ALK5基因克隆分析与组织表达模式研究

为了阐明水牛ALK5基因在水牛卵泡发生过程中的作用,了解其在水牛不同组织中的表达模式,试验采用了RT-PCR及QRT-PCR方法对ALK5基因进行了研究,参考已公布的Gen Bank中牛ALK5基因序列,设计特异性引物应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,系统分析和预测了水牛ALK5基因的遗传进化、蛋白质的理化性质、二级和三级结构,并应用QRT-PCR技术对ALK5基因在水牛组织的表达进行了差异分析。结果表明:水牛ALK5基因的编码区全长为1 512 bp,共编码503个氨基酸;水牛ALK5核苷酸序列与牛、绵羊、猪、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、97%、95%、93%和90%,结合系统进化树分析结果推测ALK5基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性;该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在low complexity和GS结构,呈典型跨膜蛋白结构;水牛ALK5基因在肺脏、垂体、下丘脑组织中不表达,在水牛大脑、肝脏、骨骼、卵巢、肌肉和心脏等12个组织细胞中具有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,心脏和肾脏次之,肌肉表达量最低。说明试验成功地克隆了沼泽型水牛ALK5基因,其具备典型的TGF-β受体家族结构,表达具有一定的组织特异性。     

水牛促卵泡素受体(FSHR)基因启动子克隆、生物信息学分析及转录活性检测

试验旨在对广西本地水牛FSHR基因5'侧翼序列进行克隆、生物信息学分析及其转录活性检测。根据GenBank已公布的黄牛FSHR 5'侧翼序列,本试验设计引物,以广西本地水牛血液基因组为模板扩增FSHR基因5'侧翼序列并进行生物信息学分析。结果显示本试验成功克隆了广西本地沼泽型水牛FSHR 5'侧翼序列及部分CDS区序列,共2979 bp,同源性比对分析结果表明其与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、猪和人的同源性分别为100%、99%、93%、92%、91%和75%。对其5'侧翼2000 bp序列进行启动子预测及转录因子结合位点预测,结果显示在其翻译起始位点上游-147 bp附近存在TATA box,启动子区存在GATAs、FOXO1、FOXO3、Nobox、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6和YY1等反式作用元件结合位点,其中GATAs家族基因在FSHR启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个GATAs家族基因结合的情况。水牛FSHR启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞系中的表达,但表达非常微弱;也能启动EGFP在CHO细胞系中表达,且与CMV启动EGFP在CHO细胞系中的强度相似,结果表明水牛FSHR是个强启动子。总之,本研究成功克隆了沼泽型水牛FSHR基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性的转录活性,为后期水牛繁殖性能分子机理阐明及基于卵巢特异性表达外源基因的转基因水牛奠定了基础。