中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP7的表达及结合特性

[目的]中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)是我国本土蜂种,也是重要的传粉昆虫和经济昆虫.气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)是蜜蜂嗅觉感知中的关键蛋白.在前人对中蜂AcerOBP7基因序列特征分析的基础上,本研究进一步对其表达特性及与气味物质的结合能力进行探究,...     

中华蜜蜂工蜂和雄蜂的触角感受器差异

[目的]了解中华蜜蜂工蜂和雄蜂触角感受器的类型、形状和数量,以探明工蜂和雄蜂在信息交流和对化学气味敏感性程度差异的原因,为丰富蜜蜂行为学和蜜蜂生物学提供参考资料.[方法]采用扫描电镜技术,观察工蜂和雄蜂触角切片,对比分析其感受器类型、数量的差异.[结果]工蜂和雄蜂的触角均呈膝状,鞭节、柄节总长度、粗细差异两者均不显著,...     

中华蜜蜂生物学特性的初步研究

中华蜜蜂(Apis cerana,Fabricius,一七九三)分布遍及全国各地,适应环境能力极强,极少发生传染性疾病,工作勤奋,是亚洲的优良蜜蜂品种。为掌握中蜂的飼养技术,我們开始对中蜂的形态特征、生理机能和生活习性进行了研究。     

RNAi介导的中华蜜蜂AcerOBP14触角电位反应

明确中华蜜蜂(Apis cerana cerana)气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)基因在RNA干扰前后的触角电生理(Electroantennogram,EAG)反应,可为中蜂嗅觉识别机制的深入研究提供理论参考依据.在前期对中蜂气味结合蛋白AcerOBP14基因序列、荧光竞争气味结合能力分析的基础上,试验进一步采用饲喂法对中蜂采集蜂AcerOBP14基因沉默后,进行qRT-PCR及EAG试验,筛选出对AcerOBP14有效干扰的序列,并比较干扰前后触角对不同气味物质EAG反应能力的变化.结果 表明,合成的2个不同片段大小的dsRNA均能够在不同程度上降低AcerOBP14 mRNA表达水平,dsAcerOBP14-1在饲喂48 h时沉默效果最好,沉默效率为68.9％.与只饲喂30％糖水的对照组相比,饲喂dsAcerOBP14-1的采集蜂触角对2-庚酮、α-法尼烯、β-罗勒烯和柠檬醛的EAG反应值极显著降低,对橙花醇和胡椒酮的EAG反应值显著降低.通过RNA干扰能够显著抑制AcerOBP14的表达,显著降低触角对报警信息素、植物花香挥发物、那氏信息素及幼虫信息素物质的电生理反应值.推测Ac-erOBP14是一种广谱结合蛋白,可能参与工蜂的采集及蜂群的秩序维持行为.     

中华蜜蜂普通气味结合蛋白ASP2的气味结合功能模式分析

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）体外重组普通气味结合蛋白AcerASP2与不同气味信息的结合功能和模式。【方法】通过诱导条件的优化和纯化,在获得的重组AcerASP2蛋白基础上,研究竞争性荧光探针1-NPN及不同结构气味信息与蛋白的相互作用关系,并通过同源建模和分子对接解析蛋白与气味信息的结合模式和机理。【结果】通过条件摸索获得了可溶性表达的重组中蜂ASP2蛋白,荧光光谱分析1-NPN与AcerASP2的解离常数K1-NPN为7.38 μmol•L-1,结合位点数n为1.0321。在7种气味信息中,4-烯丙基藜芦醚亲和力最强,其IC50和解离常数KD分别达到7.09和3.46 μmol•L-1。分子对接显示AcerASP2具有1个呈狭长的口袋状的疏水性结合内腔,4-烯丙基藜芦醚绝大部分位于该预测疏水性内腔中,且与Lys74产生2个氢键。【结论】中华蜜蜂AcerASP2由于特殊的空间结构而具有较强的气味信息结合能力,且易通过与疏水内腔中的赖氨酸残基产生氢键而促进结合。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因AcerOBP14的克隆及时空表达

【目的】克隆获得中华蜜蜂(Apis cerana cerana)Acer OBP14基因序列,并对其蛋白结构进行预测,分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异,为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织c DNA为模板利用RT-PCR技术扩增和克隆获得Acer OBP14 c DNA全长序列,并提交至Gen Bank数据库;利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MEGA5.2软件中的邻位相连法(neighbor-joining,NJ)构建Acer OBP14及其同源膜翅目昆虫OBPs的系统发育树;通过实时荧光定量PCR技术分析Acer OBP14在1、5、10、15、20、25和30日龄中华蜜蜂不同组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中m RNA的表达情况。【结果】克隆获得了中华蜜蜂气味结合蛋白基因Acer OBP14的c DNA序列(Gen Bank登录号为KT24648)。Acer OBP14的开放阅读框(ORF)长度为408 bp,编码135个氨基酸,预测其蛋白分子量为15.08 k D,理论等电点为5.44,有信号肽,无跨膜结构,且第18—127位氨基酸之间存在一个昆虫气味结合蛋白家族PBP-GOBP superfamily保守结构域;存在多个比较明显的疏水区域,可能是脂溶性气味分子的结合位点;含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。亚细胞定位分析表明,Acer OBP14属于分泌型蛋白,主要集中在内质网-高尔基体-质膜分泌途径上。Acer OBP14蛋白具有7个α螺旋,α1—α6属于典型OBPs核心螺旋,α7位于C端且暴露在蛋白表面。氨基酸同源序列比对结果显示,Acer OBP14与西方蜜蜂Amel OBP14的氨基酸序列一致性最高,达到86%;其次是大蜜蜂Ador GOBP56a-like,一致性为55%。系统进化树分析表明,同为蜜蜂属的中华蜜蜂Acer OBP14、西方蜜蜂Amel OBP14、大蜜蜂Ador GOBP56a-like、中华蜜蜂Acer OBP21和小蜜蜂Aflo GOBP56d-like聚为一个分支,切叶蜂属的苜蓿切叶蜂Mrot GOBP56a-like、侧沟茧蜂属的毁侧沟茧蜂Mdem GOBP83a-like、壁蜂属的角额壁蜂Ocor OBP3和熊蜂属的Bter GOBP56d-like和Bimp GOBP56d-like聚为另一大分支。荧光定量PCR结果显示,Acer OBP14在成蜂不同发育期的触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,其表达程度有差异。1日龄工蜂的胸部表达量最高,触角次之,且两者均极显著高于头、腹、足和翅(P0.01);其他日龄工蜂触角表达量均极显著高于其他组织(P0.01),其中20日龄工蜂的触角表达量最高。从各组织在不同发育阶段的表达量来看,触角的表达量在1日龄最低,极显著地低于其他日龄(P0.01);5、10日龄逐渐增加,15日龄突然下降,20日龄达到最高,极显著高于其他日龄(P0.01);之后又呈逐渐下降趋势。头、胸、腹、足和翅膀表达量总体上随日龄增加而呈下降趋势,5日龄之后大幅下降,之后趋于平稳且呈低丰度表达。【结论】Acer OBP14属于Minus-C OBP亚家族,具有PBP-GOBP家族的典型结构;组织表达谱结果暗示,Acer OBP14属普通气味结合蛋白GOBP,在中华蜜蜂中除嗅觉识别之外还参与其他生理功能。     

中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA的克隆及原核表达

 【目的】克隆、分析和原核表达编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的cDNA。【方法】以13个不同日龄中华蜜蜂工蜂触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白ASP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,并在pET-30a（+）/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】克隆了命名为Acer-ASP2（GenBank登录号：DQ449667）的中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2基因,该序列全长429 bp,编码142个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.7 kD和4.36。预测蛋白具有昆虫气味结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征,进一步分析表明Acer-ASP2极有可能属于GOBP家族。构建的原核表达载体pET/Acer-ASP2,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地表达出一个分子量约为21kD的融合蛋白,融合蛋白大部分以包涵体的形式存在于菌体沉淀中（约59.7%）,经洗涤和尿素梯度溶解对包涵体进行了纯化,经凝胶光密度扫描分析,约占最终产物的81.2％左右。【结论】克隆、分析和表达了一个新的编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA序列,为进一步研究其分子结构和功能奠定了基础。     

中华蜜蜂化学感受蛋白基因家族克隆及表达特征分析

【目的】完成中华蜜蜂（Apis cerana cerana）化学感受蛋白（chemosensory proteins,CSPs）基因家族的序列及表达谱鉴定,解析中蜂整个CSPs家族的表达特征与分布规律,为中蜂CSPs的生物学功能研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术扩增,克隆获得中蜂CSPs基因家族全部6条基因序列的开放阅读框（ORF）全长,并利用real-time PCR技术对中蜂所有的CSPs序列在中蜂工蜂不同发育历期及不同器官表达特征进行研究。【结果】新克隆4条基因（Ac-CSP2、Ac-CSP4、Ac-CSP5和Ac-CSP6）的开放阅读框分别为354、387、315和378 bp,分别编码117、128、104和125个氨基酸残基,预测蛋白质分子量分别为13.01、14.61、12.46和14.63 kD,等电点分别为8.86、4.53、9.60和8.71,且均具有4个保守的半胱氨酸残基,均符合昆虫CSPs的一般生化特征。中蜂与意蜂CSPs同源基因家族间具有高达95%—99%的相似性。CSPs在中蜂不同发育时期及器官的表达特征结果显示,Ac-CSP1、2、3、4在卵、幼虫和蛹期几乎不表达,其中Ac-CSP1、2、4在触角中表达量最高,而Ac-CSP3在翅中表达量最高;Ac-CSP5在中蜂各个发育历期的表达量几乎相同;Ac-CSP6蛹期有较高表达,其余时期不表达。【结论】中蜂CSPs基因家族所有6个基因的氨基酸序列与意大利蜜蜂有较高的相似性,但二者各基因的表达谱在整体相似的情况下局部又存在着某些差异,为进一步研究该家族蛋白的生理功能机制奠定了良好基础。     

气味受体基因Orco在中华蜜蜂雄蜂触角中的表达及定位分析

【目的】昆虫气味受体（odorant receptors, Ors）在其发挥嗅觉识别过程中采用的是配体门控离子通道信号传导机制,这一离子通道是由一个特定的共受体与一个普通气味受体结合为异源二聚体而形成的。其中,气味共受体（odorant receptor coreceptor, Orco）是一个十分独特的家族,在不同种类昆虫中高度保守,并在调控昆虫的嗅觉行为方面发挥关键作用。论文在对中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）工蜂Orco研究基础之上,进一步探讨雄蜂Orco的表达特性。【方法】采集中蜂1日龄雄蜂的触角、头（去除触角）、胸、腹、足5部分组织,以及不同发育阶段的幼虫、蛹及成蜂触角。提取各样本的总RNA,利用real-time quantitative PCR（qPCR）技术鉴定Orco在雄蜂不同组织及不同发育时期的表达谱;采集1日龄雄蜂触角制备冰冻切片,合成地高辛标记的寡核苷酸探针,利用原位杂交技术对Orco在雄蜂触角中的表达进行细胞定位分析。【结果】qPCR分析结果表明,Orco转录本在不同组织中的表达量表现为触角>头>足>腹>胸,其中触角表达量约为头部的100倍;Orco在雄蜂不同发育阶段均有表达,其中幼虫期和蛹期表达量较低,羽化后开始逐渐升高,性成熟后维持在一个较高的水平。此外,结合前期工蜂荧光定量试验数据,分析得到Orco在雄蜂触角中的表达量极显著高于工蜂触角表达量（P＜0.01）。原位杂交结果显示,Orco阳性杂交信号大量表达于雄蜂触角的板型感器和毛型感器的神经元细胞中。【结论】气味受体基因Orco在中蜂雄蜂的触角中大量表达,且在性成熟后表达量达到高峰。结合前期研究结果,推测Orco在中蜂中是偏雄性表达的。     

中华蜜蜂群内工蜂监督研究

以中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为实验材料,对处女蜂王分别进行单雄和双雄人工授精,并以自然交尾作为多雄交配对照。然后用标准的方法检测各蜂群对蜂王产的未受精卵(QUG)和工蜂产的未受精卵(WUG)的监督效果,结果表明:在自然交尾、双雄授精或单雄授精3种蜂群中,都明显存在工蜂监督现象。     

中华蜜蜂养殖现状与保护措施研究

作为我国农业部国家级的遗传资源的保护品种,中华蜜蜂,不但非常适合我国的山区进行定点饲养,相较于意大利蜂具有明显的优势。想要更多、更好地养殖中华蜜蜂,就必须弄清楚当地中华蜜蜂的养殖现状。还应该实施相应的保护措施。     

中华蜜蜂csd多态性分析

 【目的】分析不同地理群体中华蜜蜂（Apis cerana cerana）csd的多态性。【方法】以吉林长白山、海南海口、广西南宁、湖北神农架和江西靖安5个省市的中蜂工蜂为试验材料,提取每个工蜂样品的基因组DNA,对csd 3区进行PCR扩增、克隆和测序,分析csd的多态性。【结果】对中国5个省市的中蜂csd 3区基因组序列进行了克隆测序,获得32条csd基因单倍型,其中吉林长白山和江西靖安群体csd的多态性显著高于其它群体,而吉林长白山群体和江西靖安群体之间,广西南宁群体、海南海口群体和湖北神农架群体之间csd的多态性没有显著差异。利用csd进行群体分析表明江西靖安中蜂与吉林长白山中蜂的核苷酸分歧度和遗传距离均最大,湖北神农架中蜂与广西南宁中蜂之间核苷酸分歧度和遗传距离最小。系统进化树表明来自5个地理群体的单倍型在进化树上混杂在一起,并没有按照地理来源分为5支。【结论】中华蜜蜂csd在各个地理群体中均具有很高的多态性,并且多态性水平在群体间有差异。     

中华蜜蜂规模化养殖技术

<正>1.用活框式蜂箱饲养中华蜜蜂活框式蜂箱饲养中蜂即土蜂洋养法,就是用饲养意蜂的方法来饲养中蜂,参照意蜂的蜂箱,选择适合中蜂饲养的蜂箱、巢框、巢脾等用具,将中蜂过箱到新蜂箱里,选择在晴天无风、室外温度不低于20℃的傍晚进行过箱。这种方法为转场放蜂、用机具取蜜、一年多次取蜜、开箱检查、蜂病防治等标准化、规模化饲养奠定了基础。     

黑龙江省野生中华蜜蜂调查报告

通过对镜泊湖周边、东宁和饶河地区黑龙江省野生中华蜜蜂(Apis cerana cerana)的调查、收捕及标本观察,结果表明:野生中蜂多分布在黑龙江省东部山区,栖息于活体树洞中。标本观察中蜂工蜂体色背板以几丁质黑色为主,腹板为黄色,东南部林区多有第二背板工蜂有黄色带,个体与南方中蜂相似。收捕观测树洞巢脾分布多以斜方向或横面对着巢门,呈圆柱状,气眼分布巢脾周围,饲料集中在巢脾上部,下部为繁殖区。     

中华蜜蜂无公害饲养技术

本文从放蜂场地选择、过箱、蜂群摆放、防止异味接触、蜂群管理、越冬管理、产地环境保护等7个方面总结了中华蜜蜂无公害饲养技术,以供相关人员参考。     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂耐寒性能差异比较

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)体内抗寒系统的组成,为探究中蜂和意蜂耐寒性能的差异提供理论依据。【方法】试验选取室外相同环境条件越冬的中蜂和意蜂各5群,于2015年12月20日每群随机选取蜜蜂立即测定两者的过冷却点、冰点,比较其耐寒性能差异。然后分别测定蜂体游离水、结合水、脂肪、糖原和蛋白质含量以及海藻糖酶的活性。利用高效液相色谱测定血淋巴中山梨醇、海藻糖、甘露醇的含量。在海藻糖的生物合成通路中确定4个重要调控基因,选择β-action和β-肌动蛋白分别作为中蜂和意蜂的内参基因,采用实时荧光定量PCR检测中蜂和意蜂海藻糖4个相关调控基因在越冬期时m RNA相对表达量的差异。【结果】越冬期中蜂和意蜂过冷却点差异显著,中蜂的过冷却点显著低于意蜂(P0.05),但二者冰点没有显著性差异(P0.05);越冬期中蜂和意蜂蜂体含水量存在显著差异,中蜂体内游离水含量显著低于意蜂(P0.05),而结合水含量显著高于意蜂(P0.05);越冬中期蜂体脂肪含量在两蜂种间差异不显著(P0.05);中蜂和意蜂蜂体和血淋巴蛋白质含量差异不显著(P0.05);意蜂在越冬期时体内糖原含量明显低于中蜂,并且差异显著(P0.05);中蜂血淋巴中甘露醇、山梨醇含量接近于意蜂的两倍,海藻糖含量也相对高于意蜂,差异显著(P0.05);中蜂蜂体和血淋巴的海藻糖酶活性均显著低于意蜂(P0.05);以中蜂为对照组,实时荧光定量PCR检测意蜂的海藻糖酶基因(Tre-2)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)表达量明显高于中蜂(P0.05);而基因Tre-1表达情况相反;海藻糖合成酶基因(TPS)表达量在中蜂和意蜂体内无显著差异(P0.05)。【结论】与意蜂相比,中蜂能够通过降低体内游离水含量,提高糖原和小分子糖含量,调节海藻糖酶活性和相关基因表达等方式降低体内过冷却点,提高自身耐寒性能。     

蜜蜂所打破中华蜜蜂种群的国际认知

正近日,中国农业科学院蜜蜂研究所蜜蜂遗传与育种创新团队针对中蜂群体基因组学开展了研究,系统揭示了中华蜜蜂的群体结构、进化与适应,相关研究成果在线发表在《分子生物与进化(Molecular Biology and Evolution)》上。     

湖北省宜昌地区中华蜜蜂种质情况研究

选择具有养蜂传统的宜昌地区作为研究地,对中华蜜蜂(Apis cerana cerana)的种群特征与其多样性,进行基于形态遗传学的调查研究。研究表明,中华蜜蜂的4个主成分均能反映出工蜂形态特征的信息量,多个形态指标也同时反映出对种群间变异的贡献。对湖北省宜昌丘陵山区中华蜜蜂主要分布区域9个样本进行测定和分析,形态标记研究表明,湖北宜昌地区中华蜜蜂具有丰富的遗传多样性。     

室内人工培育中华蜜蜂幼虫技术研究

以中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）幼虫为试验材料,研究了不同饲粮配方、饲养模式和培养板对中蜂幼虫发育的影响。得出以下结果：幼虫饲粮LD1和LD3对幼虫的饲喂效果显著优于LD2;比较不同移虫模式下幼虫发育成功率：日转移法为61.1%,不转移法为70.8%;其中,在不转移饲喂模式下,使用新培养板培养的发育成功率（69.8%）显著高于重复利用的培养板培养的发育成功率（39.6%）（P〈0.01）。表明室内以LD1或LD3饲喂,采用＂不转移法＂模式,并使用新培养板,更利于中蜂幼虫的发育。     

宜昌地区中华蜜蜂养殖现状调查研究

本文选择了具有上千年养蜂传统的宜昌地区作为研究地,对宜昌地区中华蜜蜂养殖情况进行调查,尝试剖析以宜昌地区为代表的中华蜜蜂养殖业目前在政策、市场、蜂产品质量等方面存在的问题和原因,提出如何改善养蜂业的产业现状、加强相关的农业配套优惠政策的制定、执行贯彻相关优惠政策的系列建议,以期更好地促进我国养蜂行业的可持续发展。