基因芯片技术检测黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒

黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒是世界性分布的重要植物病毒,对农业生产危害较大.农作物感病多为复合侵染,症状表现较为复杂,急需建立快速、准确、能够一次检测多种病毒的检测方法.本研究根据3种病毒的外壳蛋白基因序列,设计引物和探针,制备基因芯片;用Cy3标记下游引物,RT-PCR扩增产物与芯片杂交,荧光扫描仪检测并...     

山东葫芦科蔬菜上病毒病种类检测及黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定

为了检测和鉴定山东地区葫芦科蔬菜上病毒病种类,从山东诸地11个蔬菜种植区采集了867个葫芦科蔬菜疑似感病样品。利用黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、南瓜花叶病毒、甜瓜黄斑病毒、瓜类褪绿黄化病毒、李属坏死环斑病毒及甜瓜坏死斑点病毒等特异性引物对疑似感病样品分别进行RT-PCR检测,各病毒检出率分别为34.8%,10.4%,20.0%,41.7%,27.0%,7.8%,2.6%,1.7%,0,0.9%。表明除PNRSV外,其他9种病毒在山东各地均有发生,且CMV和TMV发病率较高,2种或2种以上病毒复合侵染也很普遍。同时为明确山东地区CMV分离物的株系分化状况,选取11个地区有代表性的CMV阳性样品,测定其外壳蛋白(Coat protein,CP)和RNA3核苷酸序列并进行序列比对和进化分析,结果显示侵染山东地区葫芦科蔬菜的CMV分离物均属于IB亚组,与韩国分离物As(AF013291)相似性最高,未发现其他株系。     

蛋白激发子基因pemG1转化三生烟中及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的植物表达载体pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs转化三生烟(Nicotiana tobacum cv. Samsun NN),获得了转基因植株。用PCR检测抗卡那霉素烟苗确认阳性转化株,用Southern、Northern和Western杂交进一步证实了pemG1基因的整合、转录和表达。对T2代转基因阳性株进行烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)接种试验。接种5 d后发现,与非转基因对照相比,表达pemG1的烟草叶片枯斑数量减少,表明稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

蛋白激发子基因pemG1转化三生烟及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导转化法,将含有稻瘟菌蛋白激发子基因pemGl的植物表达载体pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs转化三生烟（Nicotiana tobacum cv．Samsun NN）,获得了转基因植株。用PCR检测抗卡那霉素烟苗确认阳性转化株,用Southern、Northern和Western杂交进一步证实了pemG1基因的整合、转录和表达。对T2代转基因阳性株进行烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus）接种试验。接种5d后发现,与非转基因对照相比,表达pemG1的烟草叶片枯斑数量减少,表明稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

蚜虫基因RNAi载体的构建及其在转基因烟草中dsRNA的表达分析

RNAi机制可以通过dsRNA诱导同源mRNA的降解,从而导致该基因转录后沉默。RNA干扰作用从发现以来就具有了利用转录后基因沉默（PTGS）来进行抗虫的一种潜在可能性。针对dsRNA的这种作用,研究中提取蚜虫RNA,克隆出蚜虫Cathepsin B基因的干扰片段并构建出RNAi载体,转入本氏烟草中,在转基因烟草体内表达dsRNA。成功构建RNAi载体后,通过农杆菌转化和叶盘法将RNAi载体导入烟草中并采用组织培养方法培养出转基因烟草,通过PCR鉴定显示15株生根的转基因烟草中14株显示阳性。提取转基因烟草的RNA进行RT-PCR和Northern表达分析显示转基因烟草植株中dsRNA表达的存在。实验结果说明了在转基因植物体内表达RNAi载体可以产生dsRNA,从而在蚜虫进食植物时达到利用dsRNA抗蚜虫的作用。     

甜(辣)椒品种(系)对黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的苗期抗性鉴定

1981—1987年,对432份甜(辣)椒材料进行了苗期抗黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)的鉴定与筛选,均未发现免疫性抗源。有84份材料耐CMV,23份抗TMV,74份耐TMV。目前生产上栽培的大果型甜椒品种基本上感CMV,耐TMV。近年育成的中椒2号和双丰甜椒对CMV和TMV都有良好的耐病性,可推广应用。     

植物提取物对烟草普通花叶病毒的抑制作用

为明确美洲商陆和绞股蓝提取物对烟草普通花叶病毒(TMV)的抑制效果,探索防治烟草病毒病防治的新思路,以期为开发植物源提取物防治烟草普通花叶病毒病提供理论依据,采用半枯叶法和大田直接喷施的方法,测定美洲商陆和绞股蓝的提取物对TMV的抑制作用和对大田TMV植株发病情况的影响,分析以上2种植物提取物对TMV的防治效果。半枯叶法的结果表明:化学防病毒药剂在25~200μg/m L浓度时均表现较好的抑制效果,其抑制率均在80%以上,与TMV不同混合时间后接种其抑制率在90%以上;美洲商陆和绞股蓝不同粗提物对TMV抑制率效果表现为甲醇提取物苯提取物石油醚提取物,美洲商陆对TMV抑制率显著高于绞股蓝,用200μg/m L浓度与TMV混合后,混合时间越长其对TMV抑制率越高;对大田烟草TMV防治效果表现为:复配制剂美洲商陆绞股蓝,且高浓度效果优于低浓度,同时,缓解了感病植株烟草农艺性状各项指标。结果表明这2种植物源提取物对TMV抑制作用显著,是防治烟草普通花叶病毒病较为理想的植物源药剂。     

烟草Nt14-3-3-like C基因的克隆与功能分析

烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）寄主范围广泛、传染性极强,严重影响作物的产量和品质。实验室前期在不同耐受 TMV侵染的烟草品种中筛选出1个表达显著差异的蛋白14-3-3-like C,在此基础上,对Nt14-3-3-like C基因进行了克隆、生物信息学分析和亚细胞定位;通过农杆菌介导遗传转化,获取转基因植株;通过qPCR对转基因植株中TMV侵染响应相关基因的表达进行分析。结果显示,14-3-3-like C蛋白序列长度为780bp,编码260个氨基酸,具有14-3-3蛋白的典型沟槽结构,但没有跨膜结构和信号肽;定位于细胞核和细胞膜;转基因材料的qPCR分析发现,在Nt14-3-3-like C基因抑制的植株中,病原防卫和光合途径相关的基因表达显著下降,表明Nt14-3-3-like C可能通过抑制病原防卫和光合途径相关基因表达参与TMV对烟草的侵染。     

裂褶菌蛋白粗提液抗植物病毒活性初探

摘要：以裂褶菌蛋为研究对象,用硫酸铵沉淀其蛋白,制成蛋白粗提液,研究其诱导烟草对烟草花叶病毒（TMV）的抗性,和体外钝化烟草花叶病毒（TMV）的防治效果;结果表明：当蛋白浓度达到100μg/mL时,诱导烟草抗TMV的效果较好,侵染枯斑抑制率可达74.11%±3.7%,对TMV的体外钝化作用的枯斑抑制率为70.05%±1.25%,表明裂褶菌蛋白粗提液通过诱导抗病性和对TMV的体外钝化作用达到了控制TMV的作用;裂褶菌蛋白粗提液对辣椒病病毒（CMV）具有很好控制作用,用100μg/mL的裂褶菌蛋白粗提液处理辣椒植株后,其对CMV的平均防效为66.46%。     

TMV、CMV双价抗性RNA沉默表达载体的构建

本研究以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子双链RNA（dsRNA）为目标,根据已报道的TMV ΔMP和CMV ΔRep的核苷酸序列设计特异性引物,分别从质粒pBIN-TMV ΔMP(i/r)、pBIN-CMV ΔRep(i/r)扩增MP基因、Rep基因,并在pGEM-T Easy 载体上将2片段串联起来,再用PCR扩增串联好的正反向MP-Rep基因。正向MP-Rep基因用BamHI和Kpn I切下,将所得基因片段与用同样酶切开的含内含子的pKAN-In相连,取名+pKAN;用同样的方法,将反向MP-Rep基因用Xba I切下,将所得基因片段与用同样酶切开的+pKAN相连,取名pKAN-In-MP-Rep,再用Not I将包括Intron和正反向MP-Rep基因在内的片段切下,将其定向插入同样酶切开的pART27上,获得重组质粒pART27-In-MP-Rep。获得的载体可以应用于植物转基因抗病毒育种工程中。     

双抗TMV＋CMV辣椒转基因工程植株的再生及抗病毒鉴定

在构建的ＴＭＶｃｐ和ＣＭＶｃｐ双价表达载体和建立辣椒高效转化体系的基础上上农杆菌介导法转化辣椒栽培品种农大４０和湘研一号，对５２个抗卡那霉素再生植株进行杂交鉴定，结果１６株为ＴＭＶｃｐ和ＣＭＶｃｐ阳性，而ＰＣＲ检测发现其中２株为假阳性株，进一步温室攻毒试验表明有７个阳性转基因植株对ＴＭＶ和ＣＭＶ同时表现为免疫。     

水杨酸对烟草抗黄瓜花叶病毒的诱导效应

通过外源水杨酸（Salicylic acid,SA）处理烟苗,研究了水杨酸处理的烟草接种黄瓜花叶病毒后,其病情指数及抗病相关酶活性和H2O2含量的变化。结果表明：接种CMV后21d,SA处理烟株的病情指数显著低于对照;SA预处理的烟株在接种CMV前后叶片内的过氧化物酶（POD）活性和过氧化氢（H2O2）含量提高,过氧化氢酶（CAT）活性下降。表明水杨酸具有诱导烟草抗黄瓜花叶病毒的效应。     

烟草抗TMV基因连锁分子标记的筛选及在抗病资源筛选中的应用

以抗TMV品种Coker176和感TMV品种K326为亲本,经杂交、自交获得F2作图群体.通过SRAP、SSR、N基因特异引物等分子标记分析结合田间TMV抗性鉴定,将TMV抗性基因定位于LG1连锁群上.TMV抗性基因位点位于标记N2和XSRP1x26之间,遗传距离分别是4.3 cM和9.6 cM.利用N2标记对84份烤...     

抑毒灵对烟草育苗期TMV的钝化作用

选用对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)具有显著钝化作用的脱脂牛奶和磷酸三钠为研究对象,通过枯斑法测定脱脂牛奶和磷酸三钠两者复配制剂（称为抑毒灵）对烟草漂浮育苗过程中被TMV污染的基质及剪叶器的钝化作用,并利用透射电镜观察抑毒灵对病毒粒体的影响,同时采用实时qPCR对TMV含量以及寄主防御蛋白相对表达量进行定量检测。抑毒灵稀释液对TMV的钝化作用表现出时间和浓度依赖性,且不同处理间抑制率差异显著。抑毒灵与TMV接种液混合3 min后可完全抑制TMV对叶片的侵染。采用500倍抑毒灵消毒1 min以上时间抑制效果最佳。剪叶器具经稀释500倍的抑毒灵浸泡不少于5 min时对TMV的钝化效果可达100%。不同浓度的抑毒灵稀释液可显著钝化基质中的TMV,抑制TMV对烟苗的侵染和发病率,基质中TMV的含量下降74.09%~90.26%,相对防效达54.83%~85.45%。此外,所有抑毒灵处理中烟苗叶片表现正常,无药害发生。钝化病毒机制研究发现,经抑毒灵稀释液共孵育后的病毒粒体断裂成微小片段,外壳蛋白受损严重,螺旋结构和柱状基本消损完。与此同时,抑毒灵可提高防御酶PPO和PAL的酶活,还可显著诱导防御基因NPR1、PAL、PR1b和PR1a的表达。综上,抑毒灵可通过直接作用于病毒粒体和诱导寄主抗性起到抗病毒效果。