紫花苜蓿LEA蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化

根据紫花苜蓿LEA蛋白MsLEA3-1基因(GenBank登录号： EU665182)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物LEAf1/ LEAf2和LEAr1/ LEAr2,以构建好的PMD-LEA质粒为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段pMD-F和pMD-R,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,经过Not I酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体pART-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到16株阳性转基因植株,为MsLEA3-1基因的功能研究奠定基础。     

麻鸡新城疫病毒SX-1株F和HN基因在真核细胞中共表达研究

以山西省农业科学院畜牧兽医研究所预防兽医研究室克隆的pG-F和pG-HN质粒为模板,PCR扩增麻鸡新城疫病毒SX-1株F基因和HN基因,并以由15个柔性氨基酸构成的柔性短肽作为Linker将F及HN基因片段体外连接,插人pCI-neo真核表达载体,构建麻鸡新城疫病毒SX-1株F基因和HN基因共表达载体pCI-F-HN,...     

iMyAP基因过表达载体转化甘蓝型油菜

本研究以甘蓝型油菜湘油15号叶片cDNA为模版,克隆油菜黑芥子酶协助蛋白iMyAP基因全长CDS,目的片段序列和GenBank上报道的甘蓝型油菜序列iMyAP12-Y10156同源性达到100%。将得到的iMyAP基因片段与pMD19-T载体连接,命名为T-1152。用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切T-1152和pHB载体,回收片段经T4DNA连接酶连接得到iMyAP基因过表达载体pHB-1152。通过农杆菌介导将pHB-1152转化至甘蓝型油菜湘油15号,PCR鉴定显示成功获得2株转基因植株。本实验为进一步研究iMyAP基因的功能奠定了良好的基础。     

RNAi介导的百合抗CMV和LMoV的载体构建

为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体,培育百合抗病毒新种质,选取感病百合叶片为试验材料,同源序列比对后选取CMV 2b基因271 bp和LMoV cp基因428 bp作为靶基因片段。首先采用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测,确定其带有CMV和LMoV病毒;之后提取感病植株叶片总RNA,反转录得到cDNA,设计带有不同酶切位点的引物,以反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增获得目的片段,产物回收纯化后,转化大肠杆菌,重组克隆。将各自的反向片段、正向片段顺次连接到载体pFGC5941上,经多次双酶切、连接、转化后,采用冻融法将构建好的载体转入农杆菌EHA105并进行重组鉴定。酶切结果表明已成功构建了分别抗CMV、LMoV的RNAi植物表达载体pFGC5941-C2和pFGC5941-L2,PCR扩增结果表明表达载体已成功转入农杆菌中。所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致,获得含载体的农杆菌可以直接应用于百合转基因抗病毒育种工程中。     

棉花pGUS-GhCOMT1基因融合载体构建及转化验证

为了深入研究GhCOMT1基因的功能,确定GhCOMT1基因对棉纤维细胞壁增厚的影响。本实验通过构建棉花木质素合成途径中的咖啡酸-O-甲基转移酶基因GhCOMT1的瞬时表达载体,用将pRTL2-GUS/NIa瞬时表达空载体连接GhCOMT1基因的目的片段,获得pGUS-GhCOMT1融合表达载体,并将其转化到棉花胚珠表皮细胞中进行表达。通过检测可以发现pGUS-GhCOMT1融合表达载体在洋葱表皮细胞及棉花胚珠表皮细胞中高效表达,表明棉花GhCOMT1基因对棉纤维的的伸长有显著的影响,同时为研究棉花纤维发育调控的分子机理提供理论基础。     

麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因真核表达载体的构建

将麻花鸡副黏病毒ZH-1株毒种接种于11日龄SPF鸡胚,收集48～96h死亡的鸡胚尿囊液.参考已发表的鸡源副黏病毒F基因序列,设计并合成了一对特异性引物,用以扩增麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因,预期扩增的F基因片段包含完整的开放阅读框.通过RT-PCR扩增出麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因片段,琼脂糖凝胶电泳回收、纯化,得到F基因片段,经EcoR I和Sal I消化,将F基因克隆进入PCI-neo载体,转化大肠杆菌DHSa,挑选菌落,经限制性核酸内切酶Sal I和EcoR I双酶切及PCR鉴定,结果证明重组真核表达载体PCI-neo-F构建成功,为下一步在哺乳动物细胞vero细胞中表达打下良好的基础.扩增的F基因测序后,与其他禽副黏病毒1型F基因进行系统发育树的分析比较,为阐明麻花鸡副黏病毒ZH-1株的遗传背景奠定了基础.     

陆地棉GhCRE1影响种子萌发初探

为明确陆地棉细胞分裂素受体基因(GhCRE1)在调控植物生长发育中的功能,为研究陆地棉GhCRE1基因调控种子萌发的分子机理提供材料,进一步从分子水平上提高种子萌发率,通过克隆陆地棉GhCRE1基因,利用基因过表达技术将该克隆片段连接至含Ubiquitin启动子的pCUbi1390载体上构建该基因的过表达载体,同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计拟南芥CRE1基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列,从而构建拟南芥CRE1基因靶向敲除载体。将以上2种载体转化农杆菌,使用花序浸染法,以拟南芥为受体材料创建GhCRE1过表达株系及基因编辑功能缺失突变体。接着利用PCR技术和qPCR技术筛选鉴定获得过量表达的GhCRE1拟南芥株系及CRE1功能缺失的拟南芥株系并收获种子,经过对比统计收获的种子与野生型种子在1/2MS培养基上的萌发势进行表型分析,进一步明确陆地棉GhCRE1基因影响种子萌发的功能。结果显示,本研究成功获得了拟南芥GhCRE1过表达株系及CRISPR基因编辑功能缺失突变体株系,且通过数据整理后发现,在种子萌发第2天时,相比野生型,2个过表达转基因株系萌发势分别提...     

拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定

克隆得到正确的拟南芥WUS基因,成功构建WUS基因组成型植物表达载体和WUS-EGFP融合基因诱导型植物表达载体,分别转化了根癌农杆菌EHA105,并用WUS基因组成型植物表达载体转化橡胶树愈伤组织,得到组织化学检测阳性的愈伤组织,为深入研究WUS基因生理生化功能做准备。用双酶切切下植物表达载体PBI121的35S-GUS片段,将其连接到pCAMBIA2301上成为中间植物表达载体pCAMBIA2301-35S-GUS。提取拟南芥总RNA,通过RT-PCR方法获得WUS基因,经过TA克隆连接到pEASY-T1载体上,再用双酶切切下WUS基因,将其取代pCAMBIA2301-35S-GUS中的GUS片段,形成pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体。同时以质粒pCAMBIA2301-EGFP为模板,PCR获得EGFP,用重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR）获得WUS- EGFP融合基因,经双酶切将融合基因连接到诱导型植物表达载体pER8上,构成pER8-WUS-EGFP诱导型植物表达载体。通过电击转化法将这两个载体成功转入根癌农杆菌EHA105中,经过双酶切检测、PCR检测与测序分析,检测结果皆完全正确,克隆的WUS基因与WUS-EGFP融合基因序列和NCBI上公布的序列也完全一致,说明这两个植物表达载体已经构建成功。另外用pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体遗传转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,经GUS染色为蓝色,说明愈伤组织转化成功。     

花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶.本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因.从花生栽培品种荔蒲大花生基因组中克隆获得编码PEPCase的基因片段(886 bp),其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%,84.37%,81.54%,81.25%,78.71%,说明我们得到PEPCase基因片段较准确.构建的反义表达载体中PEPCase基因由35S启动子所控制,将构建的反义表达载体命名为pBGPEP.为通过反义抑制技术提高花生含油量提供了基因及表达载体.     

上西早生柿ETR5基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究

据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7株阳性植株。     

气象因子对北京地区不同秋眠等级苜蓿秋季刈割后再生高度的影响

为了研究气象因子对不同秋眠等级苜蓿秋后再生性能的影响,采用完全随机区组设计,研究了美国11个标准对照秋眠等级苜蓿品种秋季刈割后再生高度与气象因子的关系。结果表明：北京地区各秋眠等级的苜蓿在秋后刈割两周后再生高度便出现显著差异,各秋眠等级苜蓿植株再生高度的变化与三个气象因子的剩余效应较小,说明其他因子对苜蓿秋季刈割后植株再生高度的影响并不显著,因此可将积温、光照时数及降水量作为研究苜蓿秋眠性的主要影响因子。其影响程度依次为积温＞光照时数＞降水量。积温和光照时数对苜蓿秋季刈割后再生高度的影响最大。积温对再生高度的影响以直接效应为主,两者呈显著的正相关关系;光照时数和降水量均通过积温对再生高度产生正效应,而其对再生高度的直接影响为负效应。     

低温胁迫对不同秋眠类型苜蓿抗寒性影响的研究

了解秋眠性对苜蓿抗寒能力的影响,用11个美国苜蓿秋眠标准对照品种,每品种随机分为1个对照组和3个处理组,研究低温胁迫对苜蓿幼苗存活和生理生化指标的影响。结果表明：在-8℃处理6h,苜蓿幼苗的存活率仅为2.75%,表明-8℃为本试验的致死温度。而非秋眠型和极非秋眠型苜蓿的存活率要低于秋眠和半秋眠类型苜蓿,秋眠习性与耐寒性存在显著相关。各品种相对电导率和丙二醛（MDA）含量随着胁迫程度加重均呈显著增加。脯氨酸含量的变化总体上呈增加趋势,而不同处理对其变化的影响有差异。超氧化物歧化酶活性随着温度的降低呈增加趋势。     

利用RAPD技术研究弱秋眠性紫花苜蓿遗传多样性

在42个供试品种中选出生长势良好的半秋眠、不秋眠紫花苜蓿（Medicago sativa L.）品种13份,用RAPD技术对其遗传多样性进行分析。结果表明,30个随机引物均能扩增出清晰的条带,数目在1～14条之间。其中12条引物占所用引物的40%,在13份材料中共产生分子量不同的126个RAPD标记,其中多态性条带116条,占92.06%。说明半秋眠、     

不同秋眠类型苜蓿品种的生产性能研究

通过对国内外42个秋眠级为2~9级的紫花苜蓿品种4个生产年的研究, 探讨苜蓿秋眠级与生产性能的关系。结果表明: (1)不同秋眠级苜蓿的干物质产量均呈第4年≈第3年＞第1年＞第2年的趋势, 其中第2生长年(2003年)天气温度较低和降雨过量是其低产的直接原因; (2)在郑州地区, 4、2秋眠级苜蓿干物质产量显著高于非秋眠品种, 其他秋眠或半秋眠苜蓿产量也程度不同地高于非秋眠苜蓿; (3)不同秋眠级的苜蓿品种第1茬产量最高, 其次为第2、3、4茬, 第5茬产量最低; (4)苜蓿的秋眠级与年干物质产量、粗蛋白质(CP)含量呈负相关, 与粗纤维(CF)呈正相关, 认为郑州地区不宜选用非秋眠品种。     

光敏色素研究进展

综述了自20世纪20年代光敏色素被发现以来的研究概况及进展。主要包括：（1）光敏色素作为主要光受体在调节从种子萌发到器官衰老的植物生长过程中所发挥的作用;（2）光敏色素的5种不同基因型及基因同源性和主要的反应方式,尤其是光敏色素的主要分子基因PhyA和PhyB在反应方式上的区别;（3）从生物化学和分子水平阐述了光敏色素的生理功能,其中包括光敏色素对细胞生长的调节,光敏色素是如何通过调节光周期反应进而调节了生长和开花的,光敏色素对基因表达的调控以及光敏色素与植物激素协同作用于植物生长和育性等;（4）虽然迄今为止人们极少研究光敏色素和植物激素在苜蓿秋眠中的作用,但对此方面提出了研究展望。     

不同秋眠级紫花苜蓿品种生产性能的对比分析研究

为获得适宜在北京地区种植的优良休眠型苜蓿品种,并利用苜蓿品种的休眠级数来指导国内苜蓿种植区划。采用随机区组法,进行了7个不同休眠级紫花苜蓿Medicago sativa在北京地区的生产性能对比分析田间试验研究,在2010年8月-2011年10月,连续2年对紫花苜蓿的出苗时间、越冬率、生长速度、再生性、草产量、干鲜比、茎叶比进行测定。结果表明：不同休眠类型的紫花苜蓿生产性能存在显著差异(P<0.05),不同品种草产量存在显著差异(P<0.05),半秋眠苜蓿的鲜草产量显著高于非秋眠苜蓿,秋眠性强的品种越冬存活率高,所有品种草产量第l茬>第2茬>第3茬;在北京地区,应主要考虑秋眠和半秋眠的高产品种的培育与引进,秋眠型和半秋眠型的紫花苜蓿均可安全越冬,生产性能较好,适宜北京地区种植,非秋眠型（7~9级）的紫花苜蓿其越冬率相对较低,植株存活率低,生产性能较低,若要在北京地区种植需采取其他农艺措施提高其越冬存活率。     

Estimating genetic relationships among historical sources of alfalfa germplasm and selected cultivars with sequence related amplified polymorphisms

Fifteen alfalfa populations consisting of six public cultivars and nine historically recognized sources of alfalfa germplasm in North American cultivars were examined using sequence related amplified polymorphisms (SRAPs). Three bulk DNA samples from each population were evaluated with fourteen different SRAP primer pairs. This resulted in 249 different amplicons, of which over 90% were polymorphic. A dendrogram from the analysis suggests that the public cultivars are quite diverse from all the historical sources of germplasm. The highest mean genetic similarity among the nine original sources of Medicago germplasm was 0.85 between PI 536535 (Peruvian) and 536536 (Indian), while the lowest (0.47) was between PI 560333 (M. falcata) and 536539 (African). The highest mean genetic similarity among the nine original sources of Medicago germplasm and the public alfalfa cultivars was 0.78 between PI 536532 (Ladak) and Vernal, while the lowest (0.59) was between PI 536539 (African) and Oneida. Relationships based on SRAP analysis appear to generally concur with expected relationships based on fall dormancy. This report demonstrates that SRAPs are a promising marker system for detecting polymorphisms in alfalfa.     

洞庭湖区14个紫花苜蓿品种产量和品质性状比较

[目的]为筛选出适合于洞庭湖区气候条件下优质紫花苜蓿品种,[方法]本试验于湖南省常德市汉寿县洞庭湖区对14个紫花苜蓿(Medicago sativa)品种产量和品质性状进行了综合评价,[结果]结果表明：播种第一年共刈割5茬,第一茬干草产量为全年最高,随着茬数的增加干草产量呈现递减的趋势;全年平均株高与秋眠级存在极显著正相关关系(P＜0.01),秋眠级高的品种株高显著高于秋眠级低的品种。所有供试品种干草品质均达到特级或一级标准,[结论]其中WL525、55v12、吉利、南苜701、WL656等5个品种各项指标表现较好,综合排名靠前,适宜于湖南洞庭湖区生长。     

基于侯选基因标记的四倍体马铃薯休眠QTL关联分析

休眠期是马铃薯(SolanumtuberosumL.)重要的块茎性状之一,寻找调控马铃薯块茎休眠的关键基因,揭示其分子机制以选育具有适宜休眠期长度的马铃薯品种,对于解决当前马铃薯产业中过长或过短休眠期带来的经济损失和食品安全隐患等问题十分关键。前期研究在二倍体马铃薯连锁群体中定位了6个加性休眠QTL,本研究拟在四倍体马铃薯育种材料中验证这些休眠QTL。基于休眠QTL连锁的候选基因标记,采用混合线性模型(MLM),模型中考虑群体结构和亲缘关系(Q+K),在四倍体马铃薯自然群体St-hzau中对马铃薯块茎休眠期进行了关联分析。5号染色体上休眠QTL DorB5.3连锁的候选基因标记S199₃00和GWD (根据葡聚糖水双激酶α-glucan water dikinase基因设计)与马铃薯块茎休眠期具有显著的关联(P<0.05),分别解释了休眠期表型变异的7.8%和3.2%,分别能增加休眠期7.1 d和4.5 d,即在二倍体马铃薯连锁群体中定位的稳定主效休眠QTL DorB5.3在四倍体马铃薯关联群体St-hzau中也表现显著, DorB5.3的稳定性在关联分析结...     

不同秋眠级数苜蓿品种吸水规律研究

以地下根系生长、地上生物量和土壤含水量之间的关系为对象,研究了8个不同秋眠级数苜蓿品种的吸水规律。结果表明:休眠和半休眠苜蓿品种的时空变化特征表现出一致性;随着生长年限的增加,土壤含水量呈递减趋势;年刈割3茬,地上生物量与苜蓿耗水量密切相关,呈“V”字型分布;生育期内,分枝期历时最长、耗水最多,开花期耗水速率最快;3年内,苜蓿根系主要分布在60 cm土层,侧根主要发生于0~40 cm层,60 cm层下无侧根发生。根系主要依靠侧根在120 cm土层内吸收土壤水分。