家禽MSTN基因转录子的克隆及真核表达

为了确定家禽中MSTN基因转录子的种类、序列及表达差异,对1日龄海兰鸡、白羽鸡和寿光鸡腿肌MSTN基因进行RT-PCR扩增、TA克隆、测序及SDS-PAGE分析。结果表明,海兰鸡、白羽鸡和寿光鸡鸡腿肌中均存在3种不同大小的MSTN cDNA;cMSTN-1由1 128 bp组成,海兰鸡与白羽鸡的cMSTN的序列相同,寿光鸡在第1 115碱基处由G变为A;cMSTN-2由985 bp组成,缺失了cMSTN-1的374～517 bp处序列;海兰鸡和白羽鸡的cMSTN-2与寿光鸡的cMSTN-2相比,均有5处碱基不同,而海兰鸡和白羽鸡只存在2处碱基不同;cMSTN-2在388～390 bp处出现UAA终止密码子;cMSTN-3由754 bp组成,缺失了374～748处的374个核苷酸,在上述三种家禽中cMSTN-3序列相同。转染成纤维细胞48 h后,pEGFP-N1-cMSTN-2表达蛋白质分子质量约为15 ku,而pEGFP-N1-cMSTN-3不表达。这是首次发现三个品种的鸡体内同时存在三种不同大小的MSTN基因转录子,该结果可为进一步确定MSTN基因的作用机理提供试验依据。     

狮头鹅与乌鬃鹅Myostatin的序列和表达分析比较

Myostatin（MSTN）是调控肌肉生长发育的重要基因.本研究旨在分析该基因在广东地方鹅种狮头鹅和乌鬃鹅中序列和表达的差异.研究使用rapid-amplification of cDNA ends（RACE）技术克隆了两鹅种MSTN基因的ORF、5′和3′UTR序列,对序列进行生信分析,并对MSTN在两鹅种不同组织,及胚胎15、23 d和1 日龄的表达进行了检测. 结果发现,两鹅种MSTN基因的ORF区和3′UTR区DNA序列差异较小,5′UTR区差异较大,狮头鹅该区域存在35 bp DNA片段缺失. 两鹅种MSTN ORF区DNA和氨基酸序列与浙东白鹅、绿头野鸭和鸡一致性最高,DNA序列一致性在94.77%以上,氨基酸序列一致性在98.40%以上. MSTN在两鹅种1日龄的腿肌中特异高表达,在心、肝、脾、肺、肾和小肠中不表达或微量表达,在胚胎15 d到1日龄的腿肌中表达逐渐升高,自胚胎期23 d起,MSTN在乌鬃鹅中的表达显著高于狮头鹅.研究为进一步探究MSTN在两鹅种胚胎肌肉发育时期可能发挥的不同调控功能奠定了基础.     

藏猪肌肉生长抑制素基因外显子1的PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了藏猪肌肉生长抑制素(MSTN)基因的单核苷酸多态性.根据GeneBank上猪MSTN基因全序列设计的两对引物,扩增了MSTN基因完整的外显子1,经SSCP分析,只有P1扩增产物存在多态性,表现为3种基因型(AA、AC和CC),A和C两种等位基因的频率分别为46.88%和53.12%.测序分析发现,CC型与AA型相比在MSTN基因编码区的第71bp处有一个A→C的单碱基突变,该突变导致编码的第24位氨基酸由天冬酰胺改变为苏氨酸.     

民猪CIRP基因的克隆与冷诱导研究

采用生物信息学结合RT-PCR的方法,克隆民猪的冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)基因,获得3个变异体序列。猪CIRP变异体1基因cDNA长1 278 bp(GenBank登录号:HQ908794),编码172个氨基酸;变异体2基因cDNA长1 653 bp(GenBank登录号:HQ908795),编码182个氨基酸;变异体3基因cDNA长1 765 bp(Genbank登录号:HQ908796),编码144个氨基酸。CIRP变异体2与变异体1相比,在其编码区的第501碱基处,出现了一段375 bp的插入片段,该插入片段的第46～48个碱基为TAG,使翻译提前终止;变异体3与变异体2相比,在其编码区的第428碱基处,出现一段115 bp插入片段,该插入片段的第5～7个碱基为TGA,使翻译提前终止。3种转录变异体的核苷酸序列同源性为86.45%,氨基酸序列同源性为87%。冷诱导后,CIRP基因在肌肉中的表达水平出现显著升高(P<0.05)。     

牦牛MSTN基因第2外显子的遗传变异分析

研究采用PCR-SSCP方法分析了牦牛MSTN基因第2外显子遗传变异特征.结果表明:在第2外显子以及80bp的部分第1内含子和102bp的部分第2内含子,共556bp的区域中存在5处点突变,表现AA、BB、AB、AC 4种基因型,由A、B和C 3个复等位基因控制.各基因型频率分别为0.884 0、0.001 4、0.106 0和0.008 6.序列分析表明等位基因B在位于第2外显子411bp处发生A→G突变,导致编码的第235位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸,其余4处突变位于等位基因C上,即位于第1内含子31bp处的G→A突变和65bp处的核苷酸缺失以及第2内含子529bp处的A→G突变,还有一处是位于第2外显子第121bp处的T→C沉默突变.     

峨边花牛肌肉生长抑制素基因cDNA克隆及序列分析

[目的]为改良峨边花牛地方品种、提高产肉率及种质资源的保存奠定基础和提供技术依据。[方法]以从乐山峨边花牛骨骼肌中提取总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增获得肌肉生长抑制素基因(MSTN)cDNA片段,将其克隆到T载体上,通过PCR鉴定阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增,得到峨边花牛MSTN基因cDNA的全序列,全长1 135 bp,包含全部的MSTN编码序列,共有3个外显子。将峨边花牛MSTN基因在GenBank上与比利时双肌牛及皮埃蒙特双肌牛比较后发现,峨边花牛在上述2种品种双肌牛的突变位点碱基未发现异常。[结论]成功地克隆峨边花牛的MSTN基因并对其进行测序对于后期表达载体的构建奠定了基础。     

福建白兔Myostatin(MSTN)基因的克隆及序列分析

为掌握福建白兔负向调控骨骼肌生长发育的肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因分子基础,应用RT-PCR和RACE技术从肌肉组织总RNA中克隆出福建白兔MSTN基因的cDNA序列并进行分析。结果表明,该基因序列全长1 551bp(GenBank登录号:KX084386),其中5′非翻译区136bp,3′非翻译区287bp,1128bp的开放阅读框,编码375个氨基酸,MSTN蛋白在第97~768核苷酸处编码的氨基酸存在1个TGF-β前肽超家族结构域,在第841~1 125核苷酸处编码的氨基酸存在1个TGF-β家族结构域。序列分析表明:福建白兔与穴兔、人、猪、家鼠、马、牛、绵羊、鹿、狒狒、猩猩、猴的MSTN核苷酸序列同源性分别为99.9%、92.8%、94.4%、86.9%、95.2%、89.1%、91.0%、90.3%、95.9%、96.4%、95.9%。研究结果为进一步开展福建白兔MSTN基因的结构、表达以及分子育种等相关研究提供了基础数据。     

陆川猪肌肉生长抑制素基因的克隆与序列分析

[目的]对陆川猪肌肉生长抑制素（MSTN）基因进行克隆及序列分析,为后期开展MSTN因表达与陆川猪肌肉生长发育及脂肪沉积的相关性研究奠定基础.[方法]根据GenBank中已发表的猪MSTN因序列（NM 214435）设计引物,以陆川猪背最长肌组织总RNA为模板,RT-PCR扩增MSTN因cDNA序列,扩增片段经纯化、克隆、鉴定和测序分析,并应用生物软件进行蛋白质二级结构预测.[结果]克隆得到陆川猪MSTN因编码区1128 bp,与GenBank已公布的约克夏、汉普夏、杜洛克、梅山猪、藏猪、广西巴马小型猪的基因同源性均在99.8％以上.陆川猪MSTN因第294位点存在特有的碱基G,但未引起氨基酸改变.蛋白质二级结构预测结果表明,陆川猪的MSTN成熟肽包含有α螺旋、β转角、延长线和无规卷曲4种二级结构元件.[结论]猪MSTN因高度保守,可作为研究陆川猪肌肉生长发育和脂肪沉积的候选基因之一.     

琅琊鸡Mx基因3'端部分序列PCR-RFLP与序列分析

[目的]为琅琊鸡分子标记辅助选择、抗病育种提供依据。[方法]利用PCR-RFLP技术对琅琊鸡Mx基因3’端片段的HaeIII的酶切多态性进行分析。[结果]琅琊鸡群体中存在Mx基因Haem酶切位点的多态性,且均有A、B2个等住基因,基因频率分别为0．562和0．438。Mx基因Hoe III酶切位点的基因型分布在琅琊鸡群体中极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P〈0．01）。对多态片段进行克隆测序分析,结果表明,该扩增片段长度大小为357bp,多态片段存在长度为31bp的碱基缺失。[结论]在山东省地方鸡种琅琊鸡眠基因3’端序列中发现存在Hoe III-RFLP。     

鹅催乳素受体基因3''''-末端序列克隆

通过比对鸡、火鸡、鸽、猪、大鼠5种动物及人催乳素受体(PRLR),并根据它们的基因cDNA保守区设计兼并引物,先扩增了鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA一段606 bp保守区序列,再以此设计基因特异性引物,利用3'-RACE技术克隆了gPRLR cDNA 3'-末端序列.序列分析表明,获得的gPRLR cDNA 3'-末端长1 876 bp,含编码区后1 656 bp的编码核苷酸、终止密码子TAA和220 bp的3'UTR.参照鸡催乳素受体基因(cPRLR),此gPRLRcDNA 3'-末端序列可分成6个外显子,其长度分别为148 bp、170 bp、145 bp、100 bp、70 bp和1 243 bp,与cPRLR cDNA最后6个外显子高度同源,终止密码子位于最后1个外显子的1 021 bp处.编码区后1 653 bp编码的551个氨基酸gPRLR C-末端与鸡PRLR同源部分的同源性达到87.7%.     

贵州黑山羊肌肉生长抑制素基因cDNA克隆及其蛋白抗原表位预测

为通过原核、真核外源表达贵州黑山羊肌肉生长抑制素(MSTN)蛋白,制备MSTN受体拮抗剂或免疫诱导山羊产生MSTN抗体,从而消除MSTN对肌肉生长的抑制作用奠定基础,采用RT-PCR技术扩增贵州黑山羊生长抑制素基因cDNA序列;应用生物信息学相关软件和方法对生长抑制素蛋白二级结构和抗原表位进行预测。结果表明:贵州黑山羊生长抑制素基因编码区全长1 128bp,编码375个氨基酸。生长抑制素蛋白二级结构以无规卷曲为主,有少量的α螺旋和β片层,少见β转角;推测生长抑制素蛋白在二级结构上可能有3个优势抗原表位区域,分别为72～78、235～240和251～254位肽段。     

猪肌生成抑制素(MSTN)基因cDNA克隆及序列分析

利用GenBank中猪肌生成抑制素(MSTN)编码序列设计引物,以湖北白猪背最长肌肌细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出MSTN基因cDNA片段。该片段全长1277bp,包含猪MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与pUCm-T载体连接,转化到DH5α大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道的一致。     

藏系绵羊MSTN基因在不同年龄不同组织的表达定量研究

[目的]研究MSTN基因在藏系绵羊不同年龄、不同组织的表达差异。[方法]根据GenBank已发表序列（NM_001009428．1）设计l对引物,以藏系绵羊组织总RNA为模板,采用实时荧光定量PCR技术（QRT—PCR）分析了MSTN基因在不同年龄阶段的真胃、瘤胃、腿肌和心肌中的基因表达量。[结果]经过内参基因校正后,综合4个组织分析,MSTN基因在6月龄藏系绵羊的相对表达量最高,是12月龄藏系绵羊的2．52倍,是羔羊的2．24倍,是9月龄的1．30倍（尸〈O．05）。且MSTN基因在腿肌中的表达量最高,在其他组织几乎未表达,在腿肌中的表达量是其瘤胃的3984．78倍,是心肌的602．69倍（P〈0．01）。[结论]为MSTN蛋白抗体的正确利用奠定了基础。     

藏系绵羊MSTN基因在不同年龄不同组织的表达定量研究

Dermatophyte infection or ringworm is a superficial cutaneous infection with one or more of the fungal species of the keratinophilic genera Microsporum, Trichophyton, or Epidermophyton and is a zoonosis with a great impact on public health. Dermatophytes were identified from rabbit sample cultures submitted to mycological examination in the Laboratory of Microbiology of the University of Tr~-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal. All samples were collected from suspected clinical cases. Dermatophytes were cultured from 4 of the 55 specimens （7.3%）. The dermatophytes isolated were Trichophyton mentagrophytes var. mentagrophytes （1.8%） and Microsporum gypseum （5.5%）. Microscopic examination was negative in all specimens. In this work, Scopulariopsis spp., a contaminant mould, was identified in 13 specimens （23.6%）. The proportion of positive samples in relation to the number of samples examined from cases suspected was very low. As all samples were collected from rabbits with compatible signs, we presume that the low prevalence of isolation was due to laboratory constraints on dermatophytes diagnosis.     

一种新的番鸭MSTN基因转录本的克隆及真核表达

    利用RT-PCR扩增 MSTN cDNA全序列,然后进行克隆、测序;将重组质粒 pEGFP-N1-MSTN-2通过脂质体瞬时转染番鸭成纤维细胞,用RT-PCR和SDS-PAGE检测其蛋白表达.结果表明,番鸭体内存在2种MSTN基因转录本,MSTN-1(EU336991)和MSTN-2(EU336992),大小分别为1128 bp和754 bp,同源性为94%;且MSTN-2是一个全新的MSTN转录本,含有1个开放阅读框,可编码124个氨基酸.将pEGFP-N1-MSTN-2转染番鸭成纤维细胞48 h后,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白表达,蛋白大小约为14 kDa.这对于进一步研究MSTN基因功能及作用机理具有重要意义.