启动子Actinl的克隆及植物表达载体的构建

通过提取水稻叶片基因组DNA，设计PCR扩增特异引物，克隆单子叶特异表达启动子Actinl基因，与T载体连接，转化E．coliDH5α，得到重组子，经酶切和序列分析鉴定，该片段分子大小为1238bp，通过序列对比分析发现与已发表的Actinl碱基序列有99．60％的同源性。特异启动子基因驱动的抗真菌肽(AFP)基因植物表达载体，就可以进行早熟禾黑麦草等单子叶牧草的遗传转化，为单子叶牧草和草坪草的抗真菌病研究提供方法。     

马属动物cyclinT1基因的扩增与真核表达载体的构建

在幔病毒复制过程中cyclinT1(CycT1)是重要的辅助因子.为了揭示慢病毒的复制机理,试验使用RT-PCR方法扩增马和驴的cyclinT1基因,并进行克隆和序列分析,然后用DNASTAR(MegAlign)软件将测得的序列和国外发表的马属动物CycT1序列(GenBank中登录号为AF137509和AF190905)进行同源性比较.结果表明:马属动物CycT1大小为2 184 bp,编码727个氨基酸;4种CycT1基因氨基酸同源性在98%以上;将扩增出的马CycT1基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切及测序鉴定证实成功构建了pcDNA3.1(+)/eCycT1重组质粒.     

家蚕抗菌肽基因Cecropin-D的克隆及其真核表达载体的构建

从家蚕中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了家蚕Cecropin-D基因编码区的cDNA,扩增出家蚕抗茵肽Cecropin-D成熟肽基因片段,重组克隆入pMD18-Tvector载体,经DNA测序,该基因为186bp,编码62个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建真核表达栽体pPlC9K-CD。本实验的研究为获得超量表达的高活性表达抗菌肽Cecropin-D以及为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定了基础。     

小尾寒羊MYL1基因启动子区的克隆、分析及蛋白表达

为研究绵羊肌球蛋白轻链1(Myosin Light Chain 1,MYL1)基因在骨骼肌中的表达调控和功能,本实验选择3只11月龄小尾寒羊,对其启动子区域进行了克隆和序列特征分析;利用Western blotting法对其编码蛋白在小尾寒羊不同组织(肝、胃、心、肺、背最长肌、脾、卵巢)中的表达进行比较分析。结果表明:MYL1基因含有多个启动子,其最佳启动子可能位于2102~2152 bp处,并且可结合有AP-2、TFIID等多种转录因子;其编码蛋白的分子量约21 ku;该蛋白只在小尾寒羊骨骼肌中表达,在其他组织中均不表达。本研究认为MYL1基因具有多个启动子,虽然其转录后存在多个可变剪接体,但翻译蛋白只有1种,属于绵羊骨骼肌组织特异性表达的基因。     

轮状病毒VP4蛋白与热稳定肠毒素融合基因的克隆及其植物表达载体的构建

利用DNA重组技术，将用PCR扩增来的VP4-ST融合基因分别克隆到原核表达载体pThioHisB及植物表达载体pBin438中，成功构建了重组表达质粒pTh—VP4-ST和pB—VP4ST。将pTh—VP4-ST进行SDS-PAGE分析，结果表明，表达的目的蛋白以包涵体形式存在，大小约40ku；同时将pB—VP4一ST转化了农杆菌EHA105。     

烟草柠檬酸合成酶基因的克隆及其光诱导型植物表达载体的构建

紫花苜蓿为多年生优质豆科牧草。我国南方地区酸性土壤分布比较广,铝害比较严重,限制了紫花苜蓿在南方地区的推广利用。提高有机酸合成酶基因的表达活性,增加有机酸的合成与分泌,有利于增强植物的耐铝性。本研究根据Genebank中已知的烟草柠檬酸合成酶(Citrate Synthase, cs)基因的序列,通过RT-PCR从烟草总RNA中扩增cs基因的cDNA,亚克隆于T载体得到重组载体pMD18-cs,对pMD18-cs中的插入片断进行核酸序列分析确认为cs基因的cDNA全长。用光诱导型启动子(Rubisco,小亚基的启动子)和双元载体pPZP211构建了cs基因的光诱导型植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs,为利用基因工程手段提高紫花苜蓿耐铝毒能力,促进其在南方地区推广利用奠定了物质基础。     

犬冠状病毒TN449株M基因的克隆与转移载体的构建

用蔗糖密度梯度离心纯化犬冠状病毒TN449株病毒液，提取总RNA并反转录，同时设计1对5’端加有BamHⅠ和HindⅢ内切酶位点的引物，对病毒cDNA进行了PCR扩增，回收PCR产物将其连接入pGEM-T Easy载体并转化大肠埃希氏菌。并对阳性重组质粒菌测序和序列分析。结果，犬冠状病毒与牛冠状病毒、猫冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、人冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鼠传染性肝炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、人重症急性呼吸道综合征病毒和猪胃肠炎病毒的同源性分别是39．39％、85．41％、83．98％、36．80％、26．64％、37．23％、93．51％、29．009／5和94．81％；犬冠状病毒M蛋白有3个疏水性结构域。同时构建了pET28a-CCV-M表达质粒。     

K88-ST融合基因的克隆及真核表达载体的构建

利用DNA重组技术，将编码K88-ST融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pCAMBIA 1302中，成功的构建了植物重组表达质粒pCAMBIA-K88-ST。并将其转化农杆菌EHA105，为K88-ST基因的进一步研究奠定基础。     

桑树病程相关蛋白基因MuPR1-2的启动子克隆及诱导表达活性

研究桑树抗病关键蛋白基因的启动子及其活性,对阐明基因的功能与表达调控机制十分重要。利用Tail-PCR技术成功地从桑树叶片基因组DNA模板中扩增得到病程相关蛋白基因MuP R1-2的启动子,将之命名为pM uP R1-2。利用PlantC ARE软件分析pM uP R1-2的核苷酸序列,发现其具有多个转录起始所必需的顺式作用元件以及多种转录因子结合位点,另外还包含多种环境因子响应元件。构建由pM uP R1-2启动GUS基因表达的植物表达载体,通过农杆菌介导的烟草瞬时表达及GUS组织化学染色分析pM uP R1-2具有启动子的功能,证实烟草叶片接种Pst DC3000菌液后能驱动下游报告基因GUS表达,pM uP R1-2具有病原菌诱导表达活性。进一步构建pM uP R1-2稳定表达的转基因拟南芥植株,通过GUS组织化学染色与GUS荧光定量分析发现pM uP R1-2不仅具有病原真菌和细菌诱导表达活性,同时具有可被多种激素诱导表达的特性和组织表达特异性。     

phyA基因的克隆及其新型表达载体的构建

直接以黑曲霉菌株F246基因组为模板，对植酸酶基因phyA的成熟肽(分子长度为1347bp)进行了PCR扩增，再将PCR产物克隆入pMD18-T质粒，经DNA测序鉴定正确后，亚克隆入表达载体pET30a^ 和pMG36e，成功构建了phyA基因2种新型表达载体。植酸酶phyA基因2种新型表达载体的构建，为进一步获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生态制剂打下了基础。     

高羊茅黔草1号SAMDC基因的克隆及植物表达载体的构建

采用高保真平末端法从高羊茅黔草1号（Festuca arundinacea cv. Qiancao No. 1）叶片cDNA中扩增S 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因（SAMDC）序列。基因测序分析表明,扩增片段含有1 835个核苷酸,包含有9 bp的微型上游阅读框、147 bp的小型上游阅读框和1 185 bp的主阅读框。微型上游阅读框和小型上游阅读框存在一个碱基重叠,主阅读框编码395个氨基酸。整个克隆片段与GenBank上注册的高羊茅FaSAMDC基因的核苷酸同源性为95.05%,编码氨基酸的同源性为98.22%。利用KpnI和PstI酶切位点将该片段插入到经贵州省草业研究所分子生物学实验室改造过的pCAMBIA1300植物表达载体的多克隆位点内,经琼脂糖凝胶电泳检测、酶切鉴定和序列测定,获得具有SAMDC基因和潮霉素抗性基因的适合于单子叶植物遗传转化的表达载体pCAM-SAMDC。通过冻融法将构建的重组质粒导入根癌农杆菌GV3101和EHA105感受态细胞中,并通过PCR反应对所获得的工程菌株进行鉴定,为进一步通过农杆菌介导法培养抗逆禾草新材料奠定了基础。     

恶臭假单胞杆菌转谷氨酰胺酶基因的克隆及原核表达载体的构建

通过PCR方法扩增恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)H76的转谷氨酰胺酶(transglutaminase,TGase)基因,然后将扩增的约800bp的基因片段克隆到pET-28a( )表达载体上,构建重组TGase的表达载体.酶切鉴定阳性的重组质粒命名为pET-TGase.核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与恶臭假单胞杆菌KT2440的相应基因有很高的同源性.该载体的构建为进一步研究转谷氨酰胺酶的生物学功能以及应用提供了基础.     

口蹄疫病毒vp1基因的克隆与植物双元表达载体的构建

通过RT．PCR法获得阿克苏（Akesu／O／58）FMDV结构蛋白基因vp1，将该基因克隆到pGEM．TEasy载体进行核苷酸序列测定。将vp1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pBin438，构建重组中间表达载体pBinVP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pBinFMDV-vP1。结果表明：vp1基因为639bp。重组中间表达载体pBinVP1经BamHI／Sal I双酶切、PCR扩增和序列测定，表明vp1基因、Kozak序列等插入pBinVP1中。在含50mg／L卡那霉素、25mg／L链霉素和50mg／L利福平的YEB培养基上筛选及对融合农杆菌质粒进行vp1基因的PCR检测，证明植物双元表达载体pBinFMDV-vP1构建正确。     

鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达

本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因核苷酸序列，设计了1对用以扩增GPV主要非结构蛋白NS1基因的引物。通过PCR技术，扩增出NS1完整基因片段1．9kb。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：GPV H1株NS1基因全长1884bp，编码627个氨基酸，与国外已发表的B株核苷酸序列同源性为98．15％。同时将该目的基因正向插入到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6P-1的BamH1多克隆位点，构建了GPV NS1的原核表达载体，成功的表达了约97KD的NS1融合蛋白。     

能源橡胶草GGPPS基因启动子的克隆及瞬时表达研究

以多年生宿根型草本植物橡胶草为材料,根据已获得的橡胶草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因序列设计引物,采用TAIL-PCR扩增到GGPPS基因5'上游大小为1131 bp的序列。采用PlantCare和PLACE软件分析,表明该序列不仅具有启动子的基本元件,同时还有与多个器官特异表达元件以及与胁迫相关的顺式作用元件,命名为pTkGGPPS(GenBank:KT901796)。将该序列代替pCAMBIA1304质粒上的CaMV 35S启动子序列,以GFP基因作为报告基因,构建pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP植物表达载体,利用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,结果表明,该启动子能够驱动GFP基因表达,具有一定的活性。TkGGPPS基因启动子克隆及瞬时表达为橡胶草中橡胶合成及组织特异性研究奠定了基础。     

水牛KDM4D基因克隆分析及其真核表达载体的构建

旨在克隆水牛组蛋白去甲基化酶KDM4D (lysine K-specific demethylase 4D)基因,对其进行生物信息学分析,并构建KDM4D基因的真核表达载体,为研究KDM4D基因在水牛体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎发育中的作用奠定基础。试验从水牛睾丸组织中提取总RNA,反转录cDNA后, RT-PCR技术克隆KDM4D基因片段,并运用生物信息学软件对序列进行分析;随后将KDM4D基因片段连接至真核表达载体pEGFP-C1,再把重组质粒转染进HEK293T细胞。结果表明,克隆所得的水牛KDM4D基因片段编码区全长1 155 bp,共编码384个氨基酸。水牛KDM4D基因与黄牛、山羊、绵羊、犬、猫、猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别为98.4%,96.6%,96.3%,84.9%,84.1%,81.4%,80.4%,77.4%,77.3%。多重比较和进化树分析结果显示,KDM4D基因在不同物种及生物进化中具有较高的保守性。蛋白结构域分析显示,克隆所得的KDM4D蛋白结构特殊,只具有1个JmjN (Jumonji N)和1个JmjC (jumonji C)结构域,与KDM4家族其他成员相比缺少PHD (plant homeodomain)和Tud (tudor)功能域。KDM4D蛋白质三级结构预测结果显示,水牛、黄牛和人3种物种间具有较高的相似性。转染结果显示,构建的重组质粒可以在HEK293T细胞中表达。本试验成功克隆水牛KDM4D基因,对其进行生物信息学分析,构建了真核表达载体pEGFP-C1-KDM4D,并在HEK293T细胞中成功表达。     

猪Mx1基因真核表达载体的构建及表达

根据GenBank中猪Mx1基因序列设计并合成引物,对Mx1基因ORF区全长1 992个碱基进行扩增。将扩增片段与pVax1载体连接,构建pVa-Mx1-ORF真核表达载体。将构建的表达载体导入BHK-21和HEK-293细胞进行表达,用RT-PCR和间接免疫荧光对表达产物进行鉴定。结果表明,所构建的pVa-Mx1-ORF表达载体在BHK-21和HEK-293细胞中成功表达。     

FMDV结构基因P1的克隆与植物双元表达载体的构建

通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构基因P1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将P1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pB in438,构建重组中间表达载体pB inP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pB inFMDV-P1。结果表明:P1基因为2 208 bp。重组中间表达载体pB inP1经BamHⅠ/SalⅠ双酶切、PCR扩增和序列测定,表明P1基因、Kozak序列等已插入pB inP1。在含50mg/L卡那霉素、25 mg/L链霉素和50 mg/L利福平的YEB培养基上筛选及对融合农杆菌质粒进行P1基因的PCR检测,证明植物双元表达载体pB inFMDV-P1构建正确。