慢病毒载体构建策略及生物安全性研究进展

慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞,是较有前途的病毒载体,来源于HIV-1型载体,能阻止形成有复制能力的HIV-1病毒,构建一个更为安全的模式是慢病毒载体构建策略的焦点。该文介绍了慢病毒载体应用过程中的不同载体系统及构建策略,对载体的生物安全性进行了分析,展望了慢病毒在基因治疗、RNA干扰及转基因领域的应用前景。     

马传染性贫血病毒的研究进展

慢病毒跟其他逆转录病毒一样,可以将前病毒基因组持久地整合到感染细胞的染色体上,并且在感染的细胞和子代细胞中表达病毒基因,可以作为将目的外源基因引入细胞的载体.慢病毒不但能够感染分裂状态的细胞,而且还具有感染非分裂细胞的能力,因而,慢病毒载体备受关注.以HIV-1为基础的慢病毒基因转移载体是目前研究最为透彻的慢病毒载体.尽管已经在增加HIV载体的生物安全性和减少产生具备复制能力的病毒方面作了很多改进,但若应用于人类临床试验,仍然存在较大的安全隐患.因此,开发非灵长类慢病毒基因转移载体系统已成为当前研究的热点之一.     

慢病毒载体法制备转基因动物研究进展

慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞,因而被发展成为重要的转基因载体,已成为制备转基因动物的一种工具,转基因效率明显提高。该文介绍了制备转基因动物的技术方法,比较了慢病毒载体制备转基因动物的特点和优势,介绍了慢病毒载体安全设计的发展,并将近年来国内外利用慢病毒载体法制备转基因动物的研究进行了概述。     

反义RNA重组逆转录病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

为探求一种快速检测反义RNA重组逆转录病毒效价的新方法，用脂质体介导法将反义RNA重组逆转录病毒载体pLXSA、pLXSB分别转染包装细胞系PA317，经G418筛选，获得数个稳定的产毒细胞克隆，择优挑选7个细胞克隆扩增培养，收集细胞上清，用异硫氰酸胍-酚一步法提取病毒RNA，进行逆转录套式PCR，检测细胞上清中的反义RNA重组逆转录病毒效价，同时用传统方法（小鼠成纤维放大法）进行测定。2种方法检测结果的比较表明，逆转录套式PCR法的特异性和敏感性均高于小鼠成纤维放大法，是一种敏感性高、特异性强、操作简便、快速的检测逆转录病毒效价的新方法。     

山羊关节炎脑炎（CAE）病毒分离和鉴定

山羊关节炎脑炎(Caprine ArthritisEncephalitis)是由慢病毒引起的山羊关节炎脑炎(以下简称为 CAE)。其病原体为CAE 病毒,该病毒的分类是属于逆转录病毒科中的慢病毒亚科,病毒为单链 RNA,基因组在感染细胞内由反转录酶转录成 DNA,整合于细胞 DNA 中成为前病毒。     

慢病毒载体的研究进展及应用

慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用。作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述。     

逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达

为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳前体基因（P1）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞（BHK-21）。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

慢病毒介导的RNAi靶向NDVP基因抑制其在CEF上的复制

通过研究慢病毒介导的RNA干扰靶向新城疫病毒P基因抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制,从而为新城疫病毒的抗病毒研究奠定基础。①针对NDVP基因设计siRNA干扰序列,构建慢病毒（lentivirus）介导的RNAi重组载体;②携带有siRNA表达元件重组慢病毒包装及其滴度测定;③包装后重组慢病毒接种CEF细胞并接毒NDV,48h分别进行Realtime RT-PCR和NDV滴度测定,并观察细胞病变情况。结果表明,本研究针对NDVNA-1株P基因2个RNAi靶位（位于开放阅读框的641和827位）设计的RNAi641和RNAi-827,对病毒复制具很强的抑制效果,且641位的重要性大于827位．     

正呼肠孤病毒反向遗传系统及病毒载体研究进展

正呼肠孤病毒（orthoreovirus）是一种分节段的双链RNA病毒，其宿主范围广泛，对人和动物健康构成了严重威胁。由于正呼肠孤病毒结构复杂，反向遗传系统构建困难，导致其相关研究滞后于其他RNA病毒。自2007年一种完全基于质粒的正呼肠孤病毒反向遗传系统被报道以来，关于正呼肠孤病毒基因和蛋白功能的研究不断增多。本文以哺乳动物正呼肠孤病毒（mammalian orthoreovirus,MRV）和禽正呼肠孤病毒（avian orthoreovirus,ARV）为例，概述了正呼肠孤病毒反向遗传系统和病毒载体研究的最新进展，并对未来发展趋势进行展望，以期为正呼肠孤病毒载体疫苗研发提供参考。     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒载体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒栽体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒疫苗研究的成就,问题及对策

按最新的病毒分类和命名，慢病毒被划为反转录病毒科的慢病毒属，并分为５个亚属８个种：灵长类慢病毒，包括人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）、人免疫缺陷病毒Ⅱ型（ＨＩＶ－２）和猴免疫缺陷病毒（ＳＩＶ）；绵羊和山羊慢病毒，包括梅迪－维斯纳病毒（ＭＶＶ）和山羊关...     

口蹄疫病毒P1 2A和3C基因重组逆转录病毒表达载体的构建

以A型口蹄疫病毒（FMDV）AV88（L）和XJ99株的P12X基因和AV88（L）3C基因的阳性克隆质粒为模板，用PCR扩增各基因片段，酶切后分步定向亚克隆至逆转录病毒表达载体pBABE-puro上经PCR、酶切鉴定及测序。结果表明，获得了2个含不同RGD基序的A型FMDV衣壳蛋白和蛋白酶基因的重组逆转录病毒表达载体pBABE-AV88（L）P1 2X3C和pBABE-XJ99 P1 2X3C，为研究安全、高效、低成本的FMDV空衣壳亚单位疫苗奠定了基础。     

不同病毒载体系统应用于水牛体细胞转基因的研究

为了筛选出能高效率感染水牛体细胞、实现基因转移的病毒表达载体系统，试验采用携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的3种不同病毒载体介导的转基因，即逆转录病毒载体(pMX-EGFP)、诱导型慢病毒载体(FUW-TETO-EGFP)和慢病毒载体(FUGW-EGFP)系统进行病毒包装，然后分别一次或二次感染不同的水牛体细胞[水牛胎儿成纤维细胞(BFFs)和水牛胃细胞(BSTC)],应用荧光显微镜观察EGFP是否表达，然后用流式细胞仪检测感染效率，最后用G418对感染效率低的病毒载体系统进行阳性细胞系筛选。结果表明：3种病毒载体系统均能感染BFFs和BSTC,实现了基因的转移和表达，FUGW-EGFP、FUW-TETO-EGFP系统对水牛体细胞的感染效率显著高于pMX-EGFP系统(P<0.05);除FUGW-EGFP系统感染BSTC外，同种类型病毒载体系统感染同种细胞，二次感染的感染效率高于一次感染，但均差异不显著(P>0.05);同一病毒载体系统一次感染BSTC的效率高于感染BFFs。说明FUGW-EGFP、FUW-TETO-EGFP系统对水牛体细胞的感染效率高于pMX-EGFP系统...     

山羊ATF6基因重组慢病毒干扰载体的构建及鉴定

为了研究ATF6通路介导的山羊胎盘滋养层细胞(goat trophoblast cell,GTC)凋亡的作用机制,需要构建激活转录因子6(ATF6)基因慢病毒干扰载体用于试验。采用RNA干扰技术,设计合成以山羊ATF6基因CDS区为靶点的shRNA,构建重组慢病毒载体、慢病毒包装、慢病毒转染、RT-qPCR和Western blot等方法,筛选出干扰效率达60%的shRNA干扰片段,构建出可用于今后ATF6通路相关研究的重组慢病病毒干扰载体,为山羊妊娠相关研究提供材料。     

猪精子与慢病毒作用机制的探讨

在制备转基因动物的方法中,精子载体法(与质粒结合)因操作简单而备受关注,但整合效率低,遗传稳定性较差,而慢病毒载体具有良好的感染效率和整合效果,慢病毒与精子孵育制备转基因动物是转基因方法的有益尝试。本研究采用这一新方法成功制备出转基因猪。为了探索精子与慢病毒的相互作用机制,首先制备慢病毒,经梯度稀释法测定其滴度为1.2×105 ifu/mL。然后,用DNA酶消化去除慢病毒液中载体质粒,将慢病毒液与精子在17℃下共孵育2h后,再用RNA酶消化慢病毒颗粒,对精子进行RT-PCR、PCR和FISH检测。结果提示,慢病毒颗粒可能进入精子中。该发现为这一转基因新方法的建立提供了理论依据。     

光与氧对金丝桃蛋白复合物抗口蹄疫病毒的活性的影响

口蹄疫是一种由病毒（口蹄疫病毒（foot—and—mouth disease virus，FMDV）属于小RNA病毒科FMDV属，完整病毒含有单股正链RNA，衣壳蛋白，无包膜）感染引起的偶蹄动物，如牛、羊、猪、骆驼、鹿等共患的急性接触性传染病。易感染口蹄疫的偶蹄动物约有70多种，马不会感染口蹄疫，但会成为口蹄疫的被动载体。1514年意大利首次发生口蹄疫。1898年，口蹄疫被确认是由病毒引起的疾病。     

小鼠ERO1α基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。     

山羊myostatin基因慢病毒RNA干扰载体的构建及效果验证

myostatin基因是肌肉生长和发育的关键负调控因子之一,该基因突变或失活的物种都呈现肌肉增大的双肌表型,暗示在家畜中使该基因失活可以增加其产肉量。为了进一步揭示myostatin在山羊胎儿成纤维细胞中的生物学功能以及制备可有效失活myostatin基因的工具,将筛选的myostatin基因潜在RNA干扰靶位点连接到慢病毒干扰载体的转移质粒中,构建慢病毒介导的RNA干扰载体,验证其干扰效果。结果表明,干扰序列与转移质粒连接正确,成功构建myostatin基因慢病毒干扰载体,慢病毒三质粒共转293T细胞,获得的慢病毒颗粒可高效转染山羊胎儿成纤维细胞,Real-time PCR检测发现慢病毒干扰载体Lv322有效减少山羊胎儿成纤维细胞中myostatin基因mRNA 75%的表达(P<0.01),Western blotting检测显示myostatin蛋白则有效降低了94%(P<0.01)。本试验为研究myostatin基因的功能及制备失活转基因动物提供有效工具以及理论基础。     

乳腺上皮细胞免疫能力评价:比较大肠杆菌感染后的乳腺组织

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是有包膜的RNA病毒。PPRSV的病毒粒子有6种包膜蛋白,主要是GP5蛋白和M蛋白,以及少量的GP2、GP3、GP4和E蛋白。GP5是重要的包膜蛋白,它与其它包膜蛋白一起参与PPRSV的形成与感染。在本试验中,为确定单独的GP5包膜蛋白在病毒侵入细胞过程中的作用,对GP5类病毒粒子的构型和感染力进行了研究。把表达GP5的质粒与带有小鼠白血病病毒（MulV）的逆转录病毒载体（pHIT60,编码MuLVGag-Pol基因;pHIT111,编码带有β-半乳糖苷酶报告基因的MuLV基因组）共转染293T细胞,使用超速离心法、蛋白质印迹及感染试验对培养基进行分析,观察到GP5包膜蛋白整合到MulV逆转录病毒载体上形成小鼠白血病的类病毒,这种类病毒能感染PAM和Mack-145细胞,并与野生型PRRSV有同样的寄主范围。该类病毒对PAM细胞的感染力可被PRSV或GP5蛋白特异性多克隆抗体有效中和。这些结果显示,GP5蛋白可能通过与寄主细胞受体相互作用,在病毒侵入细胞过程中起重要作用。GP5类病毒用于鉴别与GP5蛋白结合的细胞受体十分有用。