胚胎干细胞在遗传育种中的应用

一、胚胎干细胞的定义及来源 胚胎干细胞（Embryonic stem cell．ESC）是指极早期的胚胎细胞．也就是受精卵分裂至少达16．32个细胞时期的胚胎（又名桑椹胚）及分裂球。此时若将每个细胞分开．每个细胞都能发育成一个完整的胚胎．这些细胞组成的群体称为“内细胞团（Inner cell mass）”．胚胎千细胞便是由此分离培养建系的．这时的内细胞团尚未决定今后生长发育的走向。内细胞团在形成人的内、中、外三个胚层时开始分化．每个胚层将分别分化成个体的各种组织器官。     

小鼠胚胎计数方法的研究及应用

胚胎细胞计数是评定胚胎活力,检验胚胎体外操作方案和培养效果的常用方法。实验以昆明小鼠体内发育胚胎和体外聚合囊胚为实验材料,对几种细胞的计数方法及应用进行了详细的研究。结果表明:（1）低渗压片法的实验效果最佳。（2）根据形态学观察,结合细胞计数,可以把小鼠8-细胞以后胚胎划分为:8-细胞晚期[细胞数目为（11.9±0.65）个];同一时间收集的桑椹胚和早期囊胚细胞数目相似;不同时间收集的囊胚细胞有明显差异。（3）细胞计数分析表明:8-细胞聚合胚发育形成聚合囊胚时,其细胞数目未发生调整。     

动物胚胎干细胞及其研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES）是指从桑椹胚或附植前囊胚内细胞团分离的多潜能细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。下面介绍几种常见的动物胚胎干细胞及它们的新近研究进展。     

人胚胎原始生殖细胞的原代培养

从5－9周人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞（PGC），将其置于经过丝裂霉素C处理过的单层小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF）饲养层上培养。结果，经过培养形成的克隆以及克隆的生长方式基本符合小鼠胚胎干细胞（ES）的特性，表现为细胞核大，细胞排列紧密，界限不清，集落边缘可见分化的成纤维细胞等；将其接种于裸鼠皮下，经过29d生长，得到具有3个胚层组织结构的畸胎瘤。     

细胞松弛素B对猪孤雌胚胎和体外克隆胚胎发育能力的影响

为探讨细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）对猪孤雌胚胎和克隆胚胎发育能力的影响,本研究通过在猪体外胚胎培养基中添加不同浓度CB以及不同孵育时间的处理,筛选出CB对猪早期胚胎发育的最适浓度和最佳孵育时间,同时通过Hoechst33342染色检测猪体外囊胚孵化期的细胞数差异,进一步研究CB对孤雌胚胎和克隆胚胎发育的影响。结果显示,培养基中添加CB浓度为7.5 μg/mL时孤雌胚胎和克隆胚胎的卵裂率分别为85.00%和90.23%,囊胚率为35.68%和42.58%,均显著高于其他各组（P < 0.05）;采用7.5 μg/mL CB处理电激活后的孤雌胚胎和克隆胚胎,孤雌胚胎孵育4 h组的卵裂率（83.80%）和囊胚率最高（35.39%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）,而克隆胚胎孵育6 h组的卵裂率（83.98%）和囊胚率最高（55.62%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）。此外,Hoechst33342染色结果显示,未添加CB处理的孤雌胚胎在囊胚孵化期的细胞平均数为28个,CB处理组的孤雌胚胎和克隆胚胎细胞平均数分别为36和52个,处理组和未处理组细胞数差异显著（P < 0.05）。结果表明,猪体外孤雌胚胎用7.5 μg/mL CB 处理4 h可获得较高的卵裂率和囊胚率;体外克隆胚胎用7.5 μg/mL CB 处理6 h卵裂率及囊胚率最高,且囊胚期内细胞团细胞总数最多。CB处理有利于体外胚胎早期发育,提高克隆胚胎移植受孕率。     

小鼠胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代研究

对影响小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES细胞）培养、克隆、分离、传代效果的因素进行了探索研究。应用223枚昆明白小鼠胚胎和20枚129品系小鼠胚胎的研究结果表明，129品系小鼠胚胎比昆明白小鼠胚胎更适合作为ES细胞建系的材料，两者FS出现率差异显著（P＜0．05）；以DMEM＋10％NBS＋10％FCS为基础培养液，分别加入LIF、胰岛素、LIF＋SCF，极显著提高昆明白小鼠胚胎贴壁率，ICM生长率及F1、F2出现率（P＜0．01），而在DMEM＋10％NBS＋10％FCS＋LIF＋SCF为培养液，得到昆明白小鼠胚胎最高贴壁率、ICM生长率及传代率；4dpc胚胎传代情况显著好于3．5dpc胚胎（P＜0．05）。     

猪2-细胞胚胎细胞的电融合

为了探索猪胚胎细胞核移植技术中细胞融合参数，进行了猪２－细胞胚胎细胞的电融合。电融合时，直流电场强度为２ｋＶ／ｃｍ，脉冲时程选４０μｓ时，可获得７０．４％的融合率和６８．４％的发育率。非电解质融合液（甘露醇）对于融合率和融合胚的发育均优于电解质融合液（ＤＰＢＳ）。在直流电脉冲前的交流脉冲是必要的，可以显著提高融合率（Ｐ＜０．０５）。     

细胞因子与激素对山羊胚胎体外生产的影响

随着商业性胚胎移植技术的推广应用和动物胚胎工程技术的深入研究,对胚胎和卵母细胞的需求量日益增加,单靠超排技术获得的胚胎或卵母细胞已远远不能满足科研和生产的需要,因而推动了卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）及体外胚胎生产（IVP）等胚胎工程技术的发展。牛体外受精技术日趋成熟,体外胚胎生产已经开始走向生产应用,但山羊体外胚胎的生产效率远落后于牛,且质量不稳定。优化培养条件是提高山羊胚胎生产效率和胚胎质量的关键。文献报道,将胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、白血病抑制因子（LIF）、干细胞因子（SCF）用于绵羊、小鼠等动物的细胞培养研究取得了较理想的效果,但未见将3种成分用于山羊的报道。     

昆明白小鼠胚胎生殖细胞的分离与培养

以昆明白品系小鼠胎儿生殖嵴为材料，以不同的培养液分离培养胚胎生殖细胞（EG cells），发现小鼠胎儿肝细胞条件培养液的效果好于未添加白血病抑制因子（LIF）的基础培养液，而差于添加了1000IU／mL LIF的基础培养液。同时，试验对比了从不同胎龄胎儿分离培养原始生殖细胞（PGCs）的情况，鉴定了EG细胞的生物学特性；EG细胞经体外培养，可以分化为神经样细胞、上皮样细胞和简单类胚体。     

动物胚胎干细胞的研究概况

胚胎干细胞（ES细胞）是从早期胚胎内细胞团（ICM）或原始生殖细胞（PGCs）经体外分化抑制培养分离克隆的,ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等的研究应用中起着重要的作用.为此,介绍胚胎干细胞的生物学特性,国内外研究进展和研究动态,阐明建立ES细胞系的技术要点以及ES细胞的应用及发展前景.     

视黄酸诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究

体外胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）向生殖细胞分化可用于治疗不育症,同时也为揭示种系世代的分子机制提供最佳模型。试验旨在探讨视黄酸（retinoic acid,RA）诱导鸡胚胎干细胞（chicken embryonic stem cells,cESCs）向雄性生殖细胞（male germ cells,MGCs）分化的作用效果。利用胰蛋白酶消化法从新鲜种蛋X期鸡胚中分离胚胎干细胞,以鸡胚成纤维（chicken embryo fibroblast,CEF）细胞为滋养层,进行体外培养,利用形态法、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）染色和胚胎阶段特异性表面抗原（embryo specific surface antigen 1,SSEA-1）检测对获得的胚胎干细胞进行鉴定。结果表明,获得典型的呈巢状或岛状的cESCs克隆,细胞AKP染色呈蓝紫色,表明其具有较高的内源性AKP活性;SSEA-1鉴定结果呈阳性,显示cESCs克隆具有多能性。采用10^-5 mol/L RA诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化,镜下观察细胞形态变化,分别于诱导第0、2、4、6、8、10天提取细胞总RNA,反转录成cDNA,用于实时荧光定量PCR检测生殖细胞标志基因的表达。结果表明,在此诱导过程中,作为胚胎干细胞标志基因Nanog、Sox2表达量持续显著下降,而生殖细胞特异性基因Dazl、Stra8、c-kit、integrin α6表达量呈持续上升趋势;免疫细胞化学检测可观察到特异基因相关蛋白的阳性克隆。本研究成功分离出cESCs,可体外培养并保持未分化状态及多能性。10^-5 mol/L RA能够促进cESCs向雄性生殖细胞方向分化,可以引起生殖细胞相应基因的表达,为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供参考。     

类ES细胞自然分化为跳动的类心肌细胞的观察

胚胎干细胞简称ES细胞，是一种存在于尚未着床的早期胚胎中来分化的原始细胞，从早期胚胎中培养胚胎干细胞，首先必须分离培养出胚胎的内细胞团（即ICM团)。自1981年Evans、Kaufman及Martin等成功地培养出小鼠ES细胞以来．以胎鼠成纤维细胞(MEF)制作饲养层，培养早期胚胎．分离ICM团，进而在抑制分化的条件下，不断地进行     

添加Ge-132对牛体外胚胎发育潜能的影响

试验旨在研究添加羧乙基锗倍半氧化物（carboxyethylgermanium sesquioxide，Ge-132）对牛孤雌激活后胚胎发育率、胚胎细胞数、早期胚胎内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平及胚胎内相关凋亡基因的影响。在牛早期胚胎体外培养基中添加不同浓度的Ge-132（0、10、100和200 μg/mL），观察其对牛体外孤雌激活胚胎发育的影响；应用Hoechst对孤雌激活后第8天胚胎进行染色后制作装片，在显微镜下对细胞进行计数；用DCFH-DA染色检测早期胚胎内ROS水平，并用Image J测量荧光强度后对数据进行统计分析，用RT-PCR对胚胎内细胞凋亡相关基因（Caspase-3、Bax、Bcl-xl和Survivin）进行分析。结果显示，10 μg/mL Ge-132处理组胚胎率与对照组间无显著差异（P>0.05），但可降低1细胞期的ROS水平；10 μg/mL Ge-132处理组较对照组早期胚胎细胞数显著增加（P<0.05）；通过检测细胞凋亡相关基因mRNA转录水平发现，与对照组相比，10 μg/mL Ge-132处理组胚胎促凋亡基因Caspase-3表达水平显著降低（P<0.05），抑制细胞凋亡基因Survivin表达水平显著升高（P<0.05）。结果表明，在早期胚胎培养基中添加10 μg/mL Ge-132可降低细胞内ROS水平，减少胚胎中氧化应激诱导的细胞凋亡，从而提高孤雌激活后牛胚胎的发育潜能。     

兔胚胎的一些与分离胚胎干细胞有关的生物学特征

为获得具有发育全能性的胚胎干细胞（ＥＳ细胞），对３日龄、３．５日龄和４日龄家兔胚胎的形态结构和免疫组化特征进行了观察。家兔胚胎的外围，不仅有透明带，还包有一层很厚的胶膜。３日龄兔胚为桑椹胚；３．５日龄胚胎已出现囊胚腔，囊胚腔较小，扩增内细胞团（ＩＣＭ）占据囊腔的１／２～２／３；４日龄为囊胚，囊腔扩大，ＩＣＭ与囊胚腔的体积比值缩小。桑椹胚的卵裂球和３．５日龄、４日龄胚胎的ＩＣＭ，以碱性磷酸酶染色和胚胎阶段特异性细胞表面抗原－１（ＳＳＥＡ－１）免疫荧光标记均呈强阳性，说明它们是由未分化的细胞构成。因此，从保证全能性的角度考虑，３日龄、３．５日龄和４日龄的家兔胚胎，均可用于ＥＳ细胞的分离。     

胚胎干细胞在动物科学中的应用

胚胎干细胞（ES细胞）是在胚胎发育早期——囊胚（受精后约5-7天）中未分化的细胞。囊胚含有约140个细胞,外表是1层扁平细胞,称滋养层,可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔,腔内一侧的细胞群,称内细胞群,这些未分化的细胞可进一步分裂、分化,发育成个体。内细胞群在形成内、中、外3个胚层时开始分化。每个胚层将分别分化形成动物体的各种组织和器官。     

哺乳动物胚胎干细胞研究进展

胚胎性干细胞包括从动物早期胚胎的卵裂球、囊胚内细胞团细胞分离建系的胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）、从胚胎生殖嵴原始生殖细胞（primordial germ cell,PGC）分离建系的胚胎生殖细胞（embryonic germ cell,EGC）和来源于畸胎瘤中的胚胎性癌细胞（embryonic carcinoma cell,ECC）。ESC具有发育分化的多潜能性和无限的自我更新能力,能在体外长期培养并具有向机体各种组织细胞分化的潜能。所以,被广泛应用于胚胎发育与细胞分化调控的研究,作为修复器官与器官移植的种子细胞,并可用于转基因动物的生产。作者主要综述了干细胞的最新研究进展,ESC培养扩增诱导机制,定向分化方法。     

牛胚胎性别鉴定荧光定量PCR方法的优化与应用

旨在建立一种可检测牛早期胚胎性别的复合探针体系,减少常规PCR方法电泳所带来的污染,提高鉴定准确率,降低鉴定成本。本研究以SRY为牛胚胎性别鉴定的目标基因,以进口YCD-PCR性别鉴定试剂盒为对照组（n=9 543）,荧光定量PCR的单引物分别扩增体系（荧光单扩,FSPSA,n=6 570）和双引物混合扩增体系（荧光双扩,FDPMA,n=22 238）分别做试验组,从性别鉴定效率、无反应率、雌雄胚胎百分率和比值、移植妊娠率、雌性胚胎母犊率、不同细胞取样数下的性别鉴定结果和鉴定成本等方面进行各组间比较。结果表明,荧光单扩组的雌性胚胎百分率和性别鉴定效率极显著高于其他两组（P<0.01）,无反应率极显著低于其他两组（P<0.01）,雌雄胚胎比值与其他两组差异较大（1.03∶1 vs 1∶1.03和1∶1.02）,雌性胚胎母犊率极显著低于荧光双扩组和对照组（P<0.01）;荧光双扩组的雌性胚胎百分率、雄性胚胎百分率和雌性胚胎母犊率均与对照组无显著差异（P>0.05）,雌雄胚胎比值与对照组相似（1∶1.03和1∶1.02）,无反应率极显著低于对照组（P<0.01）,性别鉴定效率极显著高于对照组（P<0.01）。取样细胞4~6组和7~10组的性别鉴定效率极显著高于1~3组和SD（separated & died cells）组（P<0.01）,而1~3组和SD组之间及4~6组和7~10组之间差异不显著（P>0.05）。移植妊娠率4~6细胞组最高（49.68%）,但各取样组间无显著差异（P>0.05）。荧光双扩法与对照组相比,鉴定成本下降了46.76%。结果显示,荧光双扩方法产母犊准确率最高,鉴定成本较低,取样4~6细胞时的移植妊娠率最高,是一种更可行的牛胚胎性别鉴定技术,更有利于产业化推广和应用。     

氟对家蚕胚胎培养细胞毒害作用的形态学和组织学研究

用扫描电镜和透射电镜对氟中毒的家蚕胚胎培养细胞（ＢｍＮ４细胞株）进行了超微形态和组织学研究。结果中毒细胞的细胞膜、内质网、线粒体均严重损伤。氟中毒影响了细胞生物膜的透性和细胞呼吸体系。     

胚胎因素对奶牛体外受精胚胎解冻孵化影响的试验研究

对胚胎因素影响奶牛体外受精胚胎培养效果进行了研究。结果发现：在胚胎因素中，胚胎类型（冻胚和鲜胚）与胚胎发育阶段对胚胎培养效果没有显著影响（P〉0．05）；冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响显著（P〈0．01）；冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著（P〈0．05），解冻后A级胚胎存活率（80％，128／160）、囊胚孵化率（58．75％，94／160）显著高于B级胚胎存活率（59．38％，95／160）和囊胚孵化率（37．5％，60／160）（P〈0．05）；解冻水浴温度（20℃、30℃）对培养效果有极显著影响（P〈0．01）。     

高通量SNP芯片在牛体外早期胚胎染色体质量鉴定中的初步应用

旨在基于高通量SNP芯片建立一种可评估牛早期胚胎染色体质量和生产性能的方法,为胚胎牛育种提供技术支撑。本研究通过胚胎切割技术分别对荷斯坦奶牛体内囊胚(n=27)、体外囊胚(n=21)、体外2细胞胚胎(n=6)和8细胞胚胎(n=5)进行切割取样并统计发育率,其中体内囊胚组分为1/2体内胚组(切取半个胚胎)和体内滋养层(trophoblast cells, TE)组(切取体内胚胎少量TE),体外囊胚组、体外2和8细胞胚胎分别为体外TE组(切取体外胚胎少量TE)、体外2细胞(切取体外2细胞胚胎的1个卵裂球)和8细胞组(切取体外8细胞胚胎的1个卵裂球)。切割取样后进行全基因组扩增(whole-genome amplification, WGA),对扩增成功且DNA量大于1 000 ng的样品进行SNP芯片检测,芯片检出率大于90%的进行生产性能评估,低于90%的进行染色体片段缺失分析和数据填充。结果显示：1)切割部分TE后,体内TE组剩余部分和体外TE组剩余部分继续培养24 h后的发育率分别为(94.4±5.6)%和(90.5±6.6)%,而1/2体内胚组剩余部分的发育率显著降低,仅为(22....