细胞松弛素B对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

探讨融合液、激活液中添加细胞松弛素B(CCB)对延边黄牛体细胞核移植效率的影响,以摸索适合延边黄牛体细胞核移植的电融合、激活条件。结果表明,融合液中添加7.5μg/mL CCB组的桑葚胚及囊胚发育率显著高于其他3组;激活液中添加5.0μg/mL的CCB组的卵裂率、桑葚胚及囊胚发育率显著高于其他3组;融合液、激活液中同时添加CCB的囊胚发育率高于单独添加组,但是差异不显著。     

延边黄牛体细胞克隆融合条件的研究

以体外成熟培养22-24h的延边黄牛卵母细胞作为受体,颗粒细胞为供核细胞,挤压法去核,注入供体颗粒细胞到卵黄周隙中,甘露醇融合液中施加20μs时长的电脉冲刺激使之融合,复合化学方法激活,从融合前恢复培养时间、融合电场强度、甘露醇浓度等3个方面研究延边黄牛体细胞克隆的适宜融合条件．结果表明,2．5h处理组的融合率（70．9％）显著高于4．0h处理组（58．2％,P〈0．05）,2．5h处理组重组胚的卵裂率（77．9％）显著高于其它4组（P〈O．05）,其它各组间差异不显著（P〉0．05）;融合电场强度1100V／cm处理组的融合率（86．4％）显著高于900V／cm处理组（67．1％）和1200V／cm处理组（75．2％,P〈O．05）,重组胚的卵裂率（84．6％）显著高于900V／cm处理组（69．6％,P〈O．05）,囊胚发育率（26．1％）显著高于900V／cm处理组（10．0％）,1200V／cm处理组（8．0％,P〈O．05）;不同浓度的甘露醇对融合率和重组胚的卵裂率没有明显的影响,但是0．28mol／L组囊胚发育率（25．3％）显著高于0．25mol／L组（15．3％,P〈0．05）．因此,适合延边黄牛体细胞克隆的融合条件为融合前恢复培养2．5h,0．28mol／L甘露醇作为融合液,电场强度1100V／cm．     

黄牛供体细胞处理及冷冻保存对核移植率的影响

本试验以延边黄牛耳部皮肤成纤维细胞作为核移植供体细胞,研究不同的供体处理方式对体细胞核移植胚胎发育的影响。使用血清饥饿和汇合处理供体细胞,并进行了体细胞的冷冻保存,研究冷冻后的核移植效果。结果显示:(1)使用血清饥饿处理和汇合处理后,均能提高重组胚的卵裂率及囊胚发育率。(2)未冷冻组重组胚卵裂率及囊胚发育率显著高于冷冻组(P<0.05)。     

基于均匀设计优化延边黄牛卵母细胞体外成熟及核移植后卵裂体系

[目的]应用均匀设计对延边黄牛卯母细胞体外成熟及核移植后的卵裂体系进行优化。[方法]用抽吸法回收卵母细胞,在不同条件下进行卵母细胞的体外成熟培养,然后对成熟卵母细胞进行核移植、融合、激活以及胚胎的体外培养。采用均匀设计法,选用U10（10^3）均匀设计,比较了不同的卵巢保存温度、成熟培养时间以及卵泡直径大小对牛卵母细胞体外成熟率及卵裂率的影响。[结果]延边黄牛卵母细胞体外成熟的最佳条件为：在卵巢保存温度为26℃或31℃的条件下,选取直径为8．0mm的卯母细胞成熟培养24h;卵母细胞核移植后卵裂的最佳条件为：在卯巢保存温度为26℃的条件下,选取直径为6．0mm或8．0mm的卵母细胞培养24h。[结论]该结果对延边黄牛或其他种黄牛的育种及种群扩繁具有一定的参考意义。     

不同受体胞质对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

为确定延边黄牛体细胞核移植过程中卵母细胞的最佳去核时期,本试验选取体外成熟22 h的中期(MⅡ期)卵母细胞与体外成熟28 h的末期(TⅡ期)卵母细胞进行化学辅助去核操作,并将去核的卵母细胞作为受体构建重构胚,后期观察发育情况.结果显示,M期卵母细胞的显核率与TⅡ期卵母细胞的显核率无显著差异;但是TⅡ期卵母细胞所得重构胚的卵裂率及囊胚率均显著高于MⅡ期卵母细胞所得重构胚的卵裂率及囊胚率.综上所述,卵母细胞体外成熟28 h后的TⅡ期可作为延边黄牛核移植去核操作的理想时期,在TⅡ期卵母细胞中选择化学辅助去核法去核能够提高延边黄牛体细胞克隆的效率.     

利用冷冻的GV期卵母细胞制备延边黄牛核移植胚胎的研究

研究使用玻璃化冷冻、程序化冷冻和超快速冷冻3种方法冷冻延边黄牛的卵母细胞,确定适宜的延边黄牛核移植受体卵母细胞的冷冻方法。结果显示,3种冷冻方法处理的GV期卵母细胞在成熟率上相似,玻璃化冷冻法得到的卵母细胞形态正常率要高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),超快速冷冻法回收率最低。采用玻璃化冷冻法,核移植重组胚卵裂率明显高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),在融合率上,3种方法差异不显著。表明玻璃化冷冻方法对延边黄牛GV期卵母细胞冷冻效果优于程序化冷冻和超快速冷冻方法,是一种较适合延边黄牛核移植的卵母细胞冷冻方法。     

EGF和β-巯基乙醇对羔羊卵母细胞体外受精和体外发育的影响

[目的]为优化幼畜卵母细胞体外培养体系提供理论基础。[方法]研究在成熟液中添加EGF和β-巯基乙醇对绵羔羊卵母细胞受精和卵裂、囊胚情况的影响,并与成年绵羊卵母细胞进行比较。[结果]在成熟液中添加不同浓度的EGF对羔羊卵母细胞卵裂率和囊胚率无显著影响(P0.05)。添加不同浓度的β-巯基乙醇可以提高羔羊卵母细胞囊胚率,其中添加100μmol/Lβ-巯基乙醇有显著影响(P0.05),但对卵裂率影响不显著(P0.05)。羔羊卵母细胞卵裂率和囊胚率均显著低于成年羊(P0.05)。添加100μmol/L的β-巯基乙醇能显著提高羔羊卵母细胞正常受精率(P0.05),且与成年羊卵母细胞受精率差异不显著(P0.05)。未添加β-巯基乙醇多精入卵率显著高于成年羊(P0.05),而添加100μmol/L的β-巯基乙醇多精入卵率与成年羊差异不显著(P0.05)。成熟液中不添加β-巯基乙醇时未受精率(20.0%)高于成年羊组(12.3%)和β-巯基乙醇(13.5%),但差异不显著(P0.05)。[结论]添加100μmol/L的β-巯基乙醇能显著提高羔羊卵母细胞发育能力,提高正常受精的比例并减少多精子受精的发生,但羔羊卵母细胞发育能力仍显著低于成年羊。     

不同培养条件对牛核移植胚胎体外发育的影响

[目的]进一步优化牛核移植胚胎的体外培养体系。[方法]在培养液中添加谷胱甘肽和胚胎培养的0~3 d采用5%O2浓度,在不同培养条件下对牛核移植重构胚胎进行体外培养,测定卵裂率8、细胞发育率、桑椹胚率以及囊胚发育率。[结果]结果表明,试验组B的8细胞发育率(38.3%)、桑椹胚率(17.0%)和囊胚率(8.5%)与对照组A(17.9%、1.3%、1.3%)差异显著(P<0.05)。试验组B和试验组C的桑椹胚率(17.0%、11.8%)、囊胚率(8.5%、7.8%)与对照组A(1.3%、1.3%)均差异显著(P<0.05)。[结论]在培养液中添加谷胱甘肽和胚胎培养的0~3d采用低O2浓度(5%O2),能够提高牛核移植胚胎的体外发育率。     

挤压去核法和盲吸去核法在延边黄牛体细胞核移植中的对比研究

分别采用挤压去核法和盲吸去核法对延边黄牛卵母细胞进行去核处理,之后进行核移植,培养观察,比较两种去核方法对延边黄牛体细胞核移植效率的影响.挤压法的操作成功率和去核率明显高于盲吸法,盲吸法操作程序耗时比挤压法长,但是差异不显著.两种方法获得了相近的卵裂率和囊胚率,但挤压法构建的重组胚在囊胚数上高于盲吸法.挤压法在延边黄牛体细胞核移植上比盲吸法更有效.     

延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的初步研究

为了优化体细胞克隆胚胎体外培养液,提高体细胞的克隆效率,以CRlaa+5% FBS+0.3%BSA为基础培养液,分别添加0、60、80、100和120 μmol/L H_2O_2观察延边黄牛体细胞克隆胚胎的氧化损伤情况和体外发育模式,并研究1、4和7 mmol/L GSH对延边黄牛重组胚的保护作用.结果表明:(1)添加0、60、80 μmol/LH_2O_2组卵裂率显著要高于100 μmol/L和120 μmol/L组(P<0.05),添加H_2O_2的组囊胚发育率显著低于未添加组(P<0.05);(2)随着H_2O_2处珲浓度的升高,重组胚发育速度增加,但是发育停滞现象也更明显;(3)在培养液中添加GSH后,1 mmol/L组卵裂率显著高于7 mmol/L组(P<0.05),与0和4 mmol/L组差异不显著(P>0.05),囊胚发育率显著高于其它组(P<0.05).可见,在体细胞克隆胚胎体外发育过程中H_2O_2对其具有氧化损伤作用,不利其体外发育,在培养液中添加1 mmol/L GSH对体细胞克隆胚胎的氧化损伤具有明显的保护作用.     

CAPN1基因4685位点与肉质嫩度相关性研究

[目的]探索延边黄牛与草原红牛钙蛋白酶I(CAPN1)基因4685位点对肉质嫩度的影响。[方法]采用PCR-RFLP技术对草原红牛、延边黄牛CAPN1基因第14内含子区4685位点进行基因多态性与肉质嫩度进行分析,验证该位点在吉林省地方品种牛中的作用。[结果]该位点与肉质嫩度相关检测指标(蒸煮损失、肌纤维直径、剪切力、滴水损失等)密切相关,均表现为T等位基因的存在能够显著提高个体的嫩度水平,但该位点与pH无关。4685位点与屠宰性状(净肉重、胴体重、净肉率等)无关,仅与眼肌面积存在一定的相关性。[结论]延边黄牛与草原红牛CAPN1基因4685位点与肉质嫩度存在密切相关。     

基于均匀设计优化延边黄牛卵母细胞体外成熟及核移植后卵裂体系

［目的］应用均匀设计对延边黄牛卵母细胞体外成熟及核移植后的卵裂体系进行优化。［方法］用抽吸法回收卵母细胞,在不同条件下进行卵母细胞的体外成熟培养,然后对成熟卵母细胞进行核移植、融合、激活以及胚胎的体外培养。比较了在不同的卵巢保存温度、成熟培养时间以及卵泡直径大小对牛卵母细胞体外成熟率及卵裂率的影响。［结果］延边黄牛卵母细胞体外成熟的最佳条件为在卵巢保存温度为26或31℃的条件下,选取直径为8.0mm的卵母细胞成熟培养24h;卵母细胞核移植后卵裂的最佳条件为在卵巢保存温度为26℃的条件下,选取直径为6.0或8.0mm的卵母细胞培养24h。［结论］该结果对延边黄牛或其他种黄牛的育种及种群扩繁具有一定的参考意义。     

金耳原生质体制备与再生研究(英文)

[目的]对金耳原生质体制备与再生体系进行研究。[方法]采用正交试验法筛选金耳原生质体制备和再生体系中酶体系、菌龄、温度、时间、渗稳剂的最佳用法。[结果]金耳原生质体的释放方式有三种类型:酶解初期的顶端释放、侧位释放和后期的原位释放。其最佳制备条件为:液体静置培养3d的菌丝体,在1%纤维素酶+1%蜗牛酶+1%溶壁酶的混合酶液中,以0.6mol/L蔗糖为渗稳剂,36℃酶解4h,得到原生质体制备率达1.76×107个/ml;最佳再生条件为:液体静置培养5d的菌丝体,在1.5%溶壁酶的酶液中,以0.6mol/L蔗糖为渗稳剂,33℃酶解3h,得到原生质体再生率达0.22%。[结论]为金耳的原生质体融合、紫外线诱变育种、基因工程研究等提供了有益支持。     

金耳原生质体制备与再生研究

[目的]对金耳原生质体制备与再生体系进行研究。[方法]采用正交试验法筛选金耳原生质体制备和再生体系中酶体系、菌龄、温度、时间、渗稳剂的最佳用法。[结果]金耳原生质体的释放方式有3种类型:酶解初期的顶端释放、侧位释放和后期的原位释放。其最佳制备条件为:液体静置培养3 d的菌丝体,在1%纤维素酶+1%蜗牛酶+1%溶壁酶的混合酶液中,以0.6 mol/L蔗糖为渗稳剂,36℃酶解4 h,得到原生质体制备率达1.76×107个/ml;最佳再生条件为:液体静置培养5 d的菌丝体,在1.5%溶壁酶的酶液中,以0.6mol/L蔗糖为渗稳剂,33℃酶解3 h,得到原生质体再生率达0.22%。[结论]为金耳的原生质体融合、紫外线诱变育种、基因工程研究等提供了有益支持。     

延边黄牛核移植胚胎的活性氧含量的测定

为了研究延边黄牛体细胞克隆胚胎内部的活性氧水平,以延边黄牛孤雌激活胚胎为对照,用2,′7′-二氯荧光素二乙酸酯和二氢乙锭两种染料分别对体细胞克隆胚胎进行染色,测定其内部超氧阴离子和过氧化氢含量。结果表明,2细胞期处理组间超氧阴离子水平差异不显著(P0.05),其它细胞期体细胞克隆组均显著高于孤雌激活组(P0.05),过氧化氢水平各细胞期体细胞克隆胚胎均显著高于孤雌激活胚胎(P0.05)。因此,延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤水平显著高于孤雌激活胚胎。     

吉林地方特色肉牛发情周期内生殖激素变化规律研究

[目的]研究吉林地方特色肉牛发情周期体内生殖激素的变化规律,为提高国产特色肉牛繁殖效率提供理论依据。[方法]以吉林地区优质的草原红牛和延边黄牛,以及西门塔尔为试验对象,对发情周期内3个品种牛的血清与尿样中的孕酮、雌二醇,促卵泡素、促黄体素的变化进行测定和对比。[结果]发情第21天已孕与未孕肉牛的孕酮和雌二醇含量均存在极显著差异（P〈0.01）,促黄体素含量在发情当天与其他天相比有显著差异（P〈0.05）。[结论]通过检测肉牛发情早期血液中孕酮含量对发情鉴定及早期妊娠的诊断是切实可行的。     

延边肉牛产业的比较优势与专业化生产分析

[目的]为延边黄牛产业发展提供理论指导。[方法]主要运用综合比较优势指数和集中度对延边肉牛产业与吉林省肉牛产业进行比较分析。[结果]转边肉牛产业具有综合比较优势，集中度有逐年上升的趋势。[结论]延边肉牛产业具有明显的比较优势和发展潜力。     

延边黄牛GHR基因第8外显子一个新多态位点的发现

［目的］寻找可用于标记辅助选择的分子标记,为延边黄牛分子生物学选种提供依据。［方法］以46头纯种延边黄牛血样为试材,利用PCR-SSCP技术对GHR基因的第8外显子进行检测并测序,检测了延边黄牛群体内GHR的遗传变异。［结果］对扩增产物进行的SSCP检测发现,有3种基因型,分别为AA、BB、AB,其中AA、BB为纯合子,AB为杂合子。以AA和BB个体为样本的测序分析发现,有一个新多态性位点。GHR基因多态位点遗传分析表明,AA型个体较多,AB型和BB型个体较少。GHR基因的AA基因型效应在部分生长性状上优于其他基因型,差异达到显著水平。［结论］研究提示,GHR基因有可能作为延边黄牛生长性状的候选基因;在育种时应结合多个基因位点才能达到有效选育目的。     

双亚5号亚麻与罗布麻原生质体解离及体细胞杂交

[目的]探索双亚5号亚麻与罗布麻原生质体制备、电融合和培养的适宜条件,为进一步深入进行亚麻与罗布麻体细胞杂交育种研究奠定基础.[方法]以已建立的双亚5号亚麻和罗布麻胚性细胞悬浮系为材料,制备原生质体并进行电融合,培养.[结果]制备亚麻和罗布麻原生质体的最佳渗透剂分别是5.6;蔗糖和0.7 mol/L甘露醇;游离亚麻和罗布麻原生质体的最适酶组合都是0.5; Cellulase Onozuka R-10+1.0; Cellulase Onozuka RS+0.2; Pectolyase Y-23;最佳酶解时间分别是4和3 h;亚麻细胞最佳继代时间是转瓶后的第3 d,在此条件下原生质体存活率均为92.0;,产量分别达到1.24×106和22.4×106个/mL;2种原生质体电融合的最佳参数依次为:AC 8 v/cm,持续25 s-DC 1 500 v/cm,脉冲宽度为60 μs,脉冲次数1次-交流电时间为9 s,重复次数2次.在此条件下融合率达到20.5;.[结论]亚麻与罗布麻原生质体在一定的条件下可实现体细胞杂交.