表达鹅α干扰素基因重组禽痘病毒的构建及表达产物抑制鹅细小病毒活性的初步研究

为研究表达鹅α干扰素(GoIFN-α)基因重组活载体疫苗对抑制病毒增殖活性,本实验从植物血凝素刺激的延边白鹅外周血淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增gIFN-α基因,其大小为576 bp.将其与LacZ表达盒串联克隆于pSY681质粒中构建pSY681-IFN-α-LacZ转移重组质粒.采用脂质体将重组质粒转染于预感染禽痘病毒(FPV) 017株的鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝/白斑筛选获得重组禽痘病毒rFPV-IFN-α.采用间接免疫荧光和western blot方法对重组毒鉴定结果显示,GoIFN-α基因在CEF中获得表达,分子质量约为29 ku.表达的CoIFN-α对鹅细小病毒在鹅胚成纤维细胞中的复制具有抑制作用.本研究为进一步开展GoIFN-α基因重组FPV活载体疫苗的体内试验奠定了基础.     

鸡痘病毒复制非必需位点的筛选及鉴定

为筛选新的高效的鸡痘病毒(FPV)中外源基因的插入位点,本研究选择FPV ORF161与ORF162之间的基因间隔区作为重组位点,构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转移载体,以表达鸡传染性喉气管炎病毒g B基因的重组FPV(r FPV-g B)为亲本病毒,通过在鸡胚成纤维细胞(CEF)中同源重组,并经过蚀斑纯化筛选获得能够稳定表达gfp报告基因的重组病毒,命名为r FPV-g B161gfp。将r FPV-g B161gfp与亲本病毒连续传代20代,每5代进行荧光显微镜观察、PCR检测及复制动力学比较,结果表明重组病毒遗传稳定性良好,而且重组病毒与亲本病毒生长特性一致。本研究鉴定的新外源基因插入位点为构建多价重组FPV疫苗奠定了基础。     

表达H5亚型AIV HA和NA基因重组鸡痘病毒的构建及在高母源抗体商品鸡的免疫效力试验

母源抗体的干扰是重组鸡痘病毒(FPV)活载体基因工程疫苗至今未能得到推广应用的主要原因,本试验使用FPV新的复制非必需区构建的载体pP12-18构建在高母源抗体商品鸡具有较高免疫力的基因工程疫苗.将H5亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因定向插入鸡痘病毒转移载体pP12-18中,H5A和NA基因的启动子分别为PS和PE/L,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体p12LSH5HANA.将p12LSH5HANA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中.p12LSH5HANA与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-12LSH5HANA.通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒.经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性.用105PFU的rFPV-12LSH5HANA免疫无特定病原体(SPF)鸡,能激发机体产生有效的血凝抑制(HI)抗体.初步的动物试验表明,该重组病毒能使经滴鼻点眼攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为100%.在高母源抗体的商品鸡上,rFPV-12LSH5HANA与原有载体构建的重组疫苗rF-PV-11SH5HANA的免疫效力有显著差异,保护率分别为81.4%和45.4%.结果表明,选择FPV合适的复制非必需区构建载体是提高重组FPV在高母源抗体商品鸡免疫效力的有效策略之一.     

鸡痘病毒分离株及疫苗株整合网状内皮组织增生病病毒的基因分析

为了解山东地区鸡痘病毒(FPV)野毒流行株整合禽网状内皮组织增生病病毒(REV)前病毒的情况,同时比较FPV分离株和弱毒疫苗株整合REV前病毒序列的差异,本研究对山东不同地区的14个FPV分离株和国内外不同厂家的5个FPV疫苗株进行了REV前病毒整合区基因PCR扩增、核苷酸序列测定及基因分析.结果表明14个FPV分离株均整合了几乎全长的REV前病毒序列,这些序列与美国分离的FPV整合株AF246698的整合序列同源性最高,与REV标准株同源性较低;疫苗株均仅整合部分或完整的REV-LTR序列,但国产与进口疫苗株的整合序列不同,国产疫苗整合的LTR片段相对较小.研究表明所分离的山东FPV分离株均整合全长REV序列,疫苗株仅整合REV-LTR序列.然而FPV整合病毒株的致病特性、整合疫苗的安全性及对整合FPV野毒的免疫保护作用有待于进一步研究.     

表达鹅γ干扰素重组禽痘病毒的构建及其抗病毒活性的初步研究

为研究表达鹅γ干扰素(GoIFN-γ)基因重组禽痘病毒的抗病毒活性,本研究构建了在禽痘病毒(FPV)早晚期启动子LP2EP2控制下的IFN-γ基因重组禽痘病毒转移载体,将其转染至亲本禽痘病毒S-FPV-017预感染的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF),使其与禽痘病毒基因组进行同源重组,经过9轮筛选和纯化并进行PCR和间接免疫荧光检测,获得能稳定表达外源基因的重组病毒r FPV-IFNγ-LacZ。利用细胞病变抑制法检测抗病毒活性结果显示,在鸡胚成纤维细胞中重组禽痘病毒表达的IFN-γ对鹅细小病毒的复制具有显著抑制作用。本研究为制备共表达保护性抗原和γ干扰素基因的重组基因工程疫苗研究奠定基础。     

表达鹅副粘病毒F基因的禽痘重组病毒构建

本研究利用基因重组技术构建含有鹅副粘病毒(GPMV)主要保护性抗原F基因和LacZ报告基因的重组禽痘病毒转移载体;利用脂质体介导的方法将所构建的转移载体转染禽痘病毒(FPV)017株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝白筛选获得重组病毒;Western blot和间接免疫荧光试验结果显示重组禽痘病毒中F基因在CEF中获得表达,并且表达产物具有良好的反应原性;本研究为进一步的研究重组禽痘病毒的免疫保护性奠定了基础.     

禽用重组鸡痘病毒活载体疫苗研究及其应用

1 鸡痘病毒的特点、活载体的构建及作为活载体的优越性1.1 重组鸡痘病毒的特点及活载体的构建 鸡痘病毒(Fowlpox Virus,FPV)属于痘病毒科禽痘病毒属,含很大的双链DNA分子约300kb,其中存在许多病毒本身复制的非必需区(nonessential region,NER),并预计可容纳远不止25 kb的外源基因。这就可以用来研究和开发基因     

重组鸡痘病毒载体及其在禽流感疫苗中的应用

禽流感(Avian Influenza,AI)是严重威胁养禽业的烈性、病毒性传染病。禽流感病毒变异快,亚型多,仅其表面抗原血凝素(HA)的变异即会导致病毒得以逃避宿主免疫系统的监视,从而使针对该病的疫苗研究举步维艰。随着DNA重组技术的发展和应用,禽流感疫苗研究已逐步从常规疫苗向基因工程疫苗过渡。鸡痘病毒(fowlpoxvirus,FPV)载体能够高效表达外源基因,已成功应用于多种禽病源基因的表达,如马立克病毒gB及pp38基因,禽流感病毒HA和NP基因,传染性法氏囊病毒A片段的vp243或vp2基因,新城疫病毒HN及F基因等,并在接种后显示了良好的免疫原性。F…     

禽痘病毒分子生物学 Ⅰ鸡痘病毒分子生物学概论

鸡瘟病毒（FPV）是禽症病毒的代表种，其基因组是线状双股且末端闭合的单个DNA分子，全长约300kb，是目前所知最大的动物病毒基因组。近年来随着人们对鸡瘟病毒载体兴趣的增加，PPV的分子生物学研究亦越来越受到重视，集中表现在对FPV基因排布规律、DNA末端的性质、mRNA转录的特点以及启动子的结构特点有了一定的认识并且分离到许多有意义的单一基因。由于这些研究都是在与瘟菌病毒（Vacciniavirus，VV）相比较的过程中进行的，因而谈及FPV的分子生物学必然离不开痘苗病毒。1FPV基因组的排布规律最早的鸡痘病毒基因组酶切图谱是…     

介绍几类兽用新疫苗

(一)基因工程疫苗1.重组活载体疫苗。病毒活载体疫苗研究得较多,如用鸡痘病毒作为载体,表达成功的保护性抗原基因就有新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、狂犬病病毒、传染性支气管炎病毒、艾美尔球虫等。2005年12月24日,农业部在北京     

重组禽α疱疹病毒研究进展

禽α疱疹病毒可以引起多种家禽重要传染病,重组病毒是研究其基因组结构功能和新型基因工程疫苗的有效手段.文章综述了禽α疱疹病毒转移载体的构建和同源重组方法、感染性细菌人工染色体系统、基因缺失疫苗和重组活载体疫苗的最新进展.     

鸡痘病毒通用高效表达载体的构建及其初步应用

利用分子克隆技术对本室构建的高效鸡痘病毒表达载体 p1 1 S进行改造 ,在其人工合成禽痘病毒 ( FPV)强启动子 Ps的下游引入含 7个单一酶切位点的多克隆位点 ( MCS) ,构建了便于外源基因插入的通用性更强的高效单表达载体 p N1 1 S。然后将 FPV早晚期启动子 PE/ L 及其启动的鹅源新城疫病毒 NDV ZJ1株的 F基因一并插入 p N1 1 S中 ,使PE/ L 与 Ps反向串联 ,从而构建出 1个含 NDV ZJ1株 F基因的重组 FPV高效双表达载体 p N1 1 SEF,其 MCS可以用于插入其他外源基因。在此基础上 ,将 NDV ZJ1株的 HN基因插入 p N1 1 SEF的 Ps启动子下游的 MCS中 ,构建了共表达 NDV ZJ1株 F和 HN基因的重组 FPV双表达载体 p N1 1 SEFHN。将 p H1 1 SEFHN质粒 DNA与 FPV2 82 E4株共转染 CEF,得到共表达 NDV ZJ1株和 HN基因的重组 FPV,间接免疫荧光实验初步证明外源基因得到了较好的表达。表明所构建的通用高效 FPV表达载体有利于高效基因工程活载体疫苗的研制 ,具有广阔的应用前景     

鸡传染性喉气管炎病毒gD基因与ChIL-2重组禽痘病毒的构建及其免疫效力试验

将鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）gD基因和鸡白细胞介素2（ChIL-2）基因通过同源重组法重组禽痘病毒转移载体,构建含ILTVgD基因和ChIL-2基因的重组禽痘病毒转移载体rFPVIL2ILTV—gD,蓝色蚀斑纯化法纯化重组病毒,用IFA检测重组病毒中ILTVgD基因的表达和用ELISA试剂盒检测ChIL-2的表达。重组病毒rFPV—IL2-ILTV-gD免疫试验鸡,间接ELISA测定血清中ILTV抗体效价,动物试验用构建的ILTV强毒以滴鼻方式攻击各组试验鸡,结果表明,外源基因在重组禽疽病毒中得到了稳定表达;ELISA检测结果表明在免疫7d后能够检测到血清抗体,免疫21d后血清抗体达到高峰,此后便开始逐渐下降,符合疫苗免疫的消长规律;攻毒后每组鸡的发病情况可以看出重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD组和疫苗对照组对ILTV强毒攻击的保护率分别为96％和92％,而空白对照组为8％。说明构建的重组病毒rFPV-IL2-ILTV—gD免疫效力稍优于弱毒疫苗,能够较好的保护免疫鸡群。     

这些新型兽用疫苗,你认识吗

<正> 1 基因工程疫苗1.1 重组活载体疫苗病毒活载体疫苗的研究较多,如用鸡痘病毒作为载体,表达成功的保护性抗原基因就有新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、狂犬病病毒、传染性支气管炎病毒、艾美尔球虫等。2005年12月24日,农业部在北京宣布,我国已成功研制出禽流感--新城疫重组二联活疫苗,并正式批准生产。1.2 基因工程亚单位疫苗已经制成并用于生产的主要有口蹄疫基因工程亚单位疫苗、鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗,用于预防仔猪     

高效表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及免疫效力试验

将禽流感病毒血凝素 H9A基因克隆入插入载体 p FG11S中 ,通过酶切鉴定获得了正向转移载体 p FG11SHA;将其与禽痘病毒疫苗株 (w FPV)共转染鸡成纤维细胞 (CEF) ,通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒 r FPV- Ps- HA;以间接免疫荧光法证实 HA基因得到了表达。将该病毒经颈部皮下免疫 1日龄 SPF鸡 ,免疫后 15 d以 H9亚型禽流感病毒 F株翅静脉攻毒 ,攻毒后第 5天采集泄殖腔棉拭子样品进行病毒分离。将此重组病毒与以痘苗病毒 P7.5启动子表达相同基因的重组病毒 r FPV- P7.5 - HA作比较 ,结果表明 ,r FPV- Ps- HA相对于 r FPV- P7.5 - HA明显抑制了病毒的排出 ;攻毒后第 2、5、7、9、11天分别对 r FPV- Ps- HA、油乳剂灭活苗免疫鸡进行泄殖腔、气管排毒规律的检测 ,发现疫苗组均能很好地抑制排毒 ,攻毒对照组泄殖腔的排毒率明显高于气管排毒率     

鸡传染性支气管炎基因工程新疫苗

英国豪顿禽病研究所的布朗博士首先分离鸡染传性支气管炎病毒表面能刺激鸡体产生免疫力的刺突基因,定出编码。然后用鸡痘病毒的弱毒株作为载体,用同种体内重组法使上述基因与载体制成重组体,最后将重组体插入作为质粒的大肠杆菌中,大量培养这种大肠杆菌即制成鸡传染性支气管炎疫苗。     

禽网状内皮组织增生症流行现状及检测技术研究进展

禽网状内皮组织增生症(RE)是禽类一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病。近年来,国内外鸡群中网状内皮组织增生症病毒(REV)流行比较严重;REV与马立克病病毒(MDV)、鸡贫血病病毒(CAV)和J亚群禽白血病病毒(Avianleukosis virus subgroup J,ALV-J)几种免疫抑制性病毒的混合感染在我国部分养鸡场中均普遍存在,使得鸡群处于免疫力低下的状态,导致禽流感、新城疫等重要疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。另外,REV可以整合到MDV和鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)基因组中,从而导致商品化疫苗受到污染,并可用做将外源基因插入到鸡和哺乳动物细胞内的表达载体;基于REV传统检测方法的基础上,新型的分子生物学检测技术如PCR、实时荧光PCR、LAMP提高了诊断REV的敏感性和特异性。     

鸡病毒性关节炎疫苗的研究进展

禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）可引起鸡病毒性关节炎（Avian Viral arthritis,AVA）疾病,主要侵害关节滑膜、腱鞘和心肌,引起足部关节肿胀、腓肠腱断裂、跛行,是鸡的重要传染病之一。目前预防鸡病毒性关节炎（AVA）最有效的方法仍是疫苗接种,因此禽呼肠孤病毒（ARV）疫苗的研发意义非常重大。目前市场上已有许多ARV弱毒及灭活商品疫苗,对于ARV基因工程疫苗也有许多学者正对其研究。现对近几年ARV疫苗的研究进展做如下综述。     

以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒转移载体的构建及鉴定

为研制和开发以禽痘病毒为载体的重组病毒疫苗,本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt2种报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和gpt两个基因,P7.5用于启动外源基因,在早期启动子P7.5下游引入NotⅡ和AftⅡ两个酶切位点.用于外源基因的插入.为检测禽痘病毒转移载体pSY681-gfp-gpt的有效性,将H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)的HA基因插入到该载体中构建转移载体pSY681-gfp-gpt-HA9,将转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞,利用gfp和gpt同时进行双重筛选、数轮蚀斑纯化后获得了重组病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,通过PCR、western blot鉴定,结果证明,获得了能稳定表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,为今后重组禽痘病毒活载体疫苗的研制奠定了基础.     

禽痘病毒载体及其应用

禽痘病毒(fowlpox virus,FPV)载体在近几年受到越来越多学者的关注。禽痘病毒载体的原理,是把外源基因插入到病毒的适当位置,通过同源重组把外源基因重组到病毒基因组的复制非必需区域。外源基因通过修饰等过程可以得到高效的表达,表达产物生物活性及相关功能没有改变,刺激机体产生较强的免疫应答。禽痘病毒被用作表达载体后,相继成功地表达了来源于禽类病毒、动物病毒,乃至能感染人类病原体的保护性抗原基因,现已被广泛用作基因工程的重要工具。作者就禽痘病毒粒子的结构、生物学、分子生物学、禽痘病毒载体及其应用等几个方面进行了阐述。