用探针杂交法检测鸡毒支原体和滑液囊支原体

根据鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)的16SrRNA基因序列，设计并合成了探针MG和MS共同目的基因，跨幅为580bP的一对引物。用这对引物对2个标准的MG和1个标准的Ms菌株DNA模板进行聚合酶锭反应(PcR)，结果得到了预期大小约580bP的PcR产物。回收纯化琼脂糖电泳凝肢中的MG扩增产物克隆至T载体中，DIG随机引物法合成核酸探针，斑点杂交试验对MG和MS均呈阳性，检测灵敏度分别为2ng和3ng，其它对照菌(毒)株为阴性。     

鸡毒支原体

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是一种重要的禽呼吸道病原,被认为是鸡慢性呼吸道病(CRD)的首要原因;由其它微生物引起的并发症,称之为有并发的慢性呼吸道病,是当前鸡场中最常见到的疾病.由此引起的鸡或火鸡的气囊炎或窦炎在屠宰时会造成严重的损失.胴体的降级、废弃,饲料转换效     

应用多重套式PCR检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体

根据已发表的鸡毒和鸡滑液支原体血凝素基因序列pMGA和vlhA各设计两对引物,建立鉴别诊断两种支原体的多重套式PCR方法,对其进行温度条件、Ⅱ步模板浓度优化及特异性、敏感性实验。该方法在两步PCR后能特异性地扩增出MG(408 bp)和MS(688 bp)两个目的片段。应用于临床样品检测,与支原体分离、SPA检测比较结果PCR灵敏度高于病原分离。     

鸡毒支原体抗原在大肠杆菌中的表达

利用表达载体λgt11构建鸡毒支原体（MG）S6株基因文库。根据载体中lacZ基因插入失活的原理,重组子中大约69％为重组噬菌体。应用MG纯化抗体筛选文库,得到179个阳性克隆,不足重组噬菌体的1％。随机选择一个阳性克隆,收集其蛋白进行Western免疫印迹,检测到－38kD蛋白,表明在大肠杆菌中能全盛具有免疫学活性的MG蛋白,为MG的特异性血清学诊断提供良好工具。     

鸡毒支原体磷酸酶PrpC活性检测

HPr激酶/磷酸酶(PrkC/PrpC)系统在细菌和支原体中高度保守,不仅参与糖酵解酶类的磷酸化/去磷酸化,也与毒力、生物被膜等生命活动相关。克隆并突变获得编码鸡毒支原体磷酸酶PrpC的ptc1基因,经原核表达纯化后,利用底物PNPP体外检测其酶活性,并对影响该酶活性的pH、金属离子、温度等影响因子进行分析。结果表明,Ptc1蛋白具有磷酸酶活性,Mn2+为该酶辅因子,最适离子浓度为2mol/L,最适pH为8.5,最适温度为37℃。相同浓度的Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Al 3+、Hg2+等金属离子均对表达产物具有不同程度的抑制活性。初步建立了PrpC功能检测体系,为进一步深入研究PrkC/PrpC调节系统奠定基础。     

鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和TaqMan探针,建立鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit, CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R²=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。     

鸡毒支原体DNA限制性内切酶分析

应用限制性内切酶ＢａｍＨＩ,ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ消化鸡毒支原体ＤＮＡ,其电泳图谱能区别鸡毒支原体各株,比十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）更敏感,表明限制性内切酶分析为鉴别鸡毒支原体毒株,进行分子流行病学调查及确定在商品代鸡中是否疫苗株代替了ＭＧ野毒株提供了非常有用的工具。     

用PCR对鸡毒支原体感染的检测

应用已建立的检测 MG和 MS的 PCR方法 ,对人工接种鸡毒支原体后 2～ 2 0 d的 SPF鸡气管棉拭样品和气管、肺、肝、脾、胸肌、腿肌等器官和组织进行了检测 ;对现场采集的样品同样作 PCR检测。结果表明 ,上述人工样品均检测到病原 ,以气管棉拭样品检出最多 ;现场样品PCR的阳性检出率为 1 0 .2 8% ,分离培养的阳性率为 2 .8% ,敏感性前者高于后者。     

应用Dot-ELISA检测鸡毒支原体血清抗体

应用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测鸡毒支原体血清抗体＠郭建华＠陈明勇＠陈德威￥中国农业大学实验动物研究所应用Ｄｏｔ┐ＥＬＩＳＡ检测鸡毒支原体血清抗体郭建华＊陈明勇陈德威（中国农业大学实验动物研究所,北京海淀１０００９４）鸡毒支原体（ＭＧ）为慢性呼吸道病（ＣＲＤ）的...     

鸡毒支原体F株弱毒疫苗接种剂量与免疫保护力的关系

将在试管培养其中连传３６代的鸡毒支原体Ｆ株的新鲜培养物和在－２５℃保存了１８ｄ的湿疫苗分别作１０倍系列稀释,然后取不同活菌浓率的疫苗分别以０．０３３ｍｌ／只点眼接种３３日龄龄和４６日龄无鸡毒支原体和滑液支原体感染的北京白鸡,各种日龄的鸡各留一组不接种作为阴性对照,。在免疫接种后的３６ｄ和７２ｄ分别采血分离血清作抗体检测和用强毒攻击,两击后将鸡剖杀观察气囊病变结果表明：当疫苗中活菌数达到１０＾５ｃｃ     

兽用疫苗支原体污染的PCR检测技术的建立及应用

根据支原体的16 S rRNA基因设计特异性引物,以兽用疫苗中常见的支原体DNA为模板进行PCR试验,优化反应体系,建立了兽用疫苗支原体污染的PCR 检测方法,并对市场上的兽用疫苗随机抽查检测,其检出率为24.4%(22/90)。结果表明该方法特异性强,灵敏度高,有望成为兽用疫苗支原体污染的检测方法之一。     

鸡毒支原体F株的毒力回归试验

将鸡毒支原体Ｆ株经培养基连续传３６代后的菌株培养物以鼻内和胸腔内感染接种的方式在ＳＰＦ鸡体内连续回传５代,然后分别取各回传代次的Ｆ株接种无鸡毒支原体和滑液支原体感染的小雏和ＳＰＦ鸡胚,同时以没经回的原始代次作为对照,比较各代次Ｆ株的毒力变化情况。试验结果表明,经回传ＳＰＦ鸡５代的各代次Ｆ株培养物接种小雏对鸡不致病,所有接种鸡气囊 未出现病变,和未经回传ＳＰＦ鸡的Ｆ株结果完全一致;经过回传的各代次Ｆ     

利用原位杂交技术检测新疆牛结核病标本中结核菌的研究

采用原位杂交技术将地高辛标记的牛结核杆菌特异性探针即２４８ｂｐ基因片段用于检测１０份患病牛肺病变组织福尔马林固定切片标本。结果表明：基因探针原位杂交技术对切片标本的检出率较常规涂片染色高,分别为８０％和５０％,其定位观察到组织切片中的结核杆菌,又能获得有关细菌及其周围组织的原有位置关系,是一种敏感、特异的诊断方法,适应于固定标本、涂片标本的结核菌检测。     

用PCR和探针杂交法检测鸡败血霉形体

根据鸡败血霉形体ｆＭＧ－２核酸片断序列,设计合成了１对２５ｂｐ寡核苷酸引物,对鸡败血霉形体基因组ＤＮＡ进行扩增,均获得预期的７３２ｂｐ扩增产物,检测灵敏度为１ｂｐ;参考菌株ＤＮＡ无扩增。回收纯化琼脂糖电泳凝胶中的扩增产物,ＤＩＧ随机引物法合成核酸探讨,Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ杂交试验,鸡败血霉形体呈阳性,检测灵敏度为１００ｐｇ;其他为阴性。对自然发病鸡群检测进一步表明,建立的ＰＣＲ和探针杂交法具有高度的灵     

猪圆环病毒2型原位杂交检测技术的建立与应用

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列设计引物，利用PCR扩增得到PCV2BF株341bp的核酸片段，用随机引物法制备出地高辛标记的核酸探针。制备的探针与PCV1、PRRSV、PPV、PRV等不发生反应，可检测的最低PCV2DNA含量为1．78Pg。对30份临床组织样本进行了检测，并与PCR比较，结果表明，阴性符合率为100％，阳性符合率为88．9％。应用原位杂交技术分析了PCV2在人工感染仔猪主要组织中的分布，结果表明，感染后3d，从仔猪的淋巴结、胸腺、肺脏、脾脏、鼻黏膜可检测到阳性信号，感染后21d，肝脏、肾脏、胰腺和回肠可检出阳性信号，至感染后42d，可从心脏、胃、脑检出阳性信号。在整个试验过程中会厌软骨、膀胱、皮肤、肌肉等组织均为阴性。本研究结果表明，建立的PCV2原位杂交技术具有良好的敏感性和特异性，可用于PCV2的实验室诊断和感染靶细胞的定位分析。     

应用单克隆抗体ＡＣ—ＥＬＩＳＡ检测鸡蛋卵黄中鸡毒支原体

采用抗鸡毒支原体阳性血清包被酶标板作为捉抗体，以４株鸡毒支原体特异单克隆抗体作为第二抗体和酶标羊抗鼠ＩgG作为指示体建立了一种检测鸡蛋卵黄中鸡毒支原体的双夹心ＡＣ－ＥＬＩＳＡ。该法具有简便、灵敏、快速等优点，从采样到获得结果６小时内完成，检出率高于分离培养法，且重复性良好，该方法的建立鸡群毒支原体感染的检测和净化提供了一种新的可靠方法。     

SPF鸡人工感染鸡败血霉形体后呼吸系统的病理变化

10日龄SPF鸡气囊接种鸡败血霉形体（MG）R株，3－5天后出现的典型的MG感染症状，呼吸系统发生一系列典型的病理组织学变化。感染鸡和对照鸡的气管经固定、脱水、临界点干燥、镀金后置于扫描电镜下观察，感染鸡气管粘膜明显水肿，部分纤毛脱落或全部脱落。电镜下可见感染鸡的气管粘膜水肿增厚近2倍，粘膜下层单核细胞积聚，其间有数量不等的淋巴细胞聚集，粘液细胞显著减少或消失；气囊粘膜水肿增厚；肺组织中有淋巴细胞增生形成的结节，对照鸡呼吸系统的组织切片无变化。     

中国野桑蚕DNA多态性研究初报

用RAPD技术对浙江省、陕西省和重庆地区的野桑蚕及家蚕品种C1 0 8和大造进行了DNA多态分析。结果发现 :中国野桑蚕具有极为丰富的遗传多样性 ,就DNA多态性而言 ,不仅地区之间有很大的差异 ,同一地区不同个体之间的DNA多态性差异也类似家蚕品种之间的差异 ;同时 ,野桑蚕也与家蚕有较大的相似性 ,其共有的DNA带数高达 1 3 6%,相似系数也在 0 6以上 ,这从另一个侧面证明家蚕是从野桑蚕进化而来的